The metabolism of Sertoli cells is highly active to maintain nutritional needs of germ cells. After glucose incorporation, only 1-3% is converted to glycogen suggesting low levels of glycogen synthase. Additionally, expression levels of muscular glycogen synthase (MGS), isoform present in these cells, do not correlate with the low levels of glycogen. Furthermore, MGS has a predicted Rossmann ...
Zusammenfassung (Englisch)
The metabolism of Sertoli cells is highly active to maintain nutritional needs of germ cells. After glucose incorporation, only 1-3% is converted to glycogen suggesting low levels of glycogen synthase. Additionally, expression levels of muscular glycogen synthase (MGS), isoform present in these cells, do not correlate with the low levels of glycogen. Furthermore, MGS has a predicted Rossmann conformation, indicative of enzyme-RNA interaction. The aim of this work was to functionally characterize and explore a new feature of MGS as RNA binding protein in primary culture of Sertoli cells and the Sertoli 42GPA9 cell line. MGS was detected in the cytoplasm of Sertoli cells as well as in their nucleus. The activity rates of the enzyme were very low indicating that MGS is being expressed but is practically inactive. This correlates with high levels of MGS phosphorylation suggested by phosphatase treatments of Sertoli cells extracts and 2D gel electrophoresis of immunoprecipitated MGS. To revert the low levels of glycogen synthesis in Sertoli cells, Protein Targeting to Glycogen (PTG) overexpression and lithium treatments were performed and confirmed that MGS is present but inactive. Thus, to explore a putative new function of MGS in Sertoli cells, the analysis of enzyme localization and protein interactions revealed that the enzyme co-localized and co-immunoprecipitated with AGO2 and other RNA binding proteins. In addition, after the study of MGS interaction with mRNAs by RNA inmunoprecipitation coupled to a microarray, several mRNAs were pulled down with the enzyme, which was confirmed by mass spectrometry. The identities of those mRNAs were classified by molecular function and biological processes where the main associated categories were nucleic acid binding and transcription, respectively. The results presented in this work indicate that MGS is expressed but inactive, and moreover, reveal a novel function as the interaction with RNAs and RNA binding proteins, suggesting that MGS could play an unknown role in the regulation of mRNA expression of transcription regulation-related genes in Sertoli cells.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der Stoffwechsel der Sertoli-Zellen ist hoch aktiv, um den Nährstoffbedarf der Keimzellen zu decken. Nach dem Einbau von Glucose werden nur 1-3% in Glykogen umgewandelt, was auf einen niedrigen Gehalt an Glykogensynthase hindeutet. Darüber hinaus korrelieren die Expressionsspiegel der in diesen Zellen vorhandenen Muskelglykogensynthase (MGS) -Isoform nicht mit den niedrigen Glykogenspiegeln. ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der Stoffwechsel der Sertoli-Zellen ist hoch aktiv, um den Nährstoffbedarf der Keimzellen zu decken. Nach dem Einbau von Glucose werden nur 1-3% in Glykogen umgewandelt, was auf einen niedrigen Gehalt an Glykogensynthase hindeutet. Darüber hinaus korrelieren die Expressionsspiegel der in diesen Zellen vorhandenen Muskelglykogensynthase (MGS) -Isoform nicht mit den niedrigen Glykogenspiegeln. Darüber hinaus weist MGS eine vorhergesagte Rossmann-Konformation auf, die auf eine Enzym-RNA-Wechselwirkung hinweist. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues Merkmal von MGS als RNA-Bindungsprotein in der Primärkultur von Sertoli-Zellen und der Sertoli 42GPA9-Zelllinie funktional zu charakterisieren und zu untersuchen. MGS wurde sowohl im Zytoplasma von Sertoli-Zellen als auch in deren Zellkern nachgewiesen. Die Aktivitätsraten des Enzyms waren sehr niedrig, was darauf hinweist, dass MGS exprimiert wird, aber praktisch inaktiv ist. Dies korreliert mit hohen MGS-Phosphorylierungswerten, die durch Phosphatasebehandlungen von Sertoli-Zellextrakten und 2D-Gelelektrophorese von immunpräzipitiertem MGS nahegelegt wurden. Um die niedrigen Spiegel der Glykogensynthese in Sertoli-Zellen wiederherzustellen, wurden Protein-Targeting zur Überexpression von Glykogen (PTG) und Lithium-Behandlungen durchgeführt und bestätigt, dass MGS vorhanden, aber inaktiv ist. Um eine mutmaßliche neue Funktion von MGS in Sertoli-Zellen zu untersuchen, ergab die Analyse der Enzymlokalisierung und Proteinwechselwirkungen, dass das Enzym mit AGO2 und anderen RNA-Bindungsproteinen co-lokalisiert und co-immunopräzipitiert ist. Zusätzlich wurden nach der Untersuchung der MGS-Wechselwirkung mit mRNAs durch RNA-Inunopräzipitation, gekoppelt an einen Microarray, mehrere mRNAs mit dem Enzym heruntergezogen, was durch Massenspektrometrie bestätigt wurde. Die Identitäten dieser mRNAs wurden nach molekularen Funktionen und biologischen Prozessen klassifiziert, wobei die wichtigsten assoziierten Kategorien die Nukleinsäurebindung bzw. -transkription waren. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass MGS exprimiert, aber inaktiv ist und darüber hinaus eine neue Funktion als Wechselwirkung mit RNAs und RNA-bindenden Proteinen aufweist, was darauf hindeutet, dass MGS eine unbekannte Rolle bei der Regulation der mRNA-Expression im Zusammenhang mit der Transkriptionsregulation spielen könnte Gene in Sertoli-Zellen.
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