| License: Creative Commons Attribution 4.0 PDF - Accepted Version (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-405077
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.40507
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 7 January 2020 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralph Witzgall |
| Date of exam: | 16 July 2019 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie > Prof. Dr. Ralph Witzgall |
| Keywords: | Nail-patella syndrome; Lmx1b; podocytes; actin; Abra; Arl4c; Transgelin; focal adhesions; Rho GTPases |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 40507 |
Abstract (English)
Mutations of LMX1B lead to the hereditary disease NPS, which is associated with renal symptoms (Witzgall, 2017). Within the kidney, the transcription factor LMX1B is exclusively expressed in podocytes and plays an essential role in the maturation and maintenance of the cell. Previous studies revealed not only the putative Lmx1b target genes Abra, Arl4c and Sm22, but also evidence of an impact of ...
Abstract (English)
Mutations of LMX1B lead to the hereditary disease NPS, which is associated with renal symptoms (Witzgall, 2017). Within the kidney, the transcription factor LMX1B is exclusively expressed in podocytes and plays an essential role in the maturation and maintenance of the cell. Previous studies revealed not only the putative Lmx1b target genes Abra, Arl4c and Sm22, but also evidence of an impact of Lmx1b on the regulation of the podocyte actin cytoskeleton and focal adhesions (Burghardt et al., 2013; Stepanova, 2016). Therefore, the main purpose of the present work was to identify and investigate pathways linking Lmx1b and its target genes to the actin cytoskeleton and focal adhesions and to clarify the nature of actin and focal adhesion dysregulation in disease.
By the use of an inducible podocyte-specific Lmx1b knock-out mouse line with an mTmG reporter construct, knock-out of Lmx1b could be induced at a desired time point in podocytes of mature mice, and those podocytes could be separated from other glomerular cells. Analysis of the protein expression in podocytes by western blotting confirmed an increased expression of Arl4c and transgelin following Lmx1b knock-out. While Arl4c is most likely a direct target of Lmx1b, transgelin expression seems to be a general response to podocyte damage (Marshall et al., 2011). The expression of Abra in wild-type or knock-out podocytes could not be confirmed free of doubt.
Primary murine podocytes were used to clarify the impact of Lmx1b on the actin cytoskeleton. To better resemble the physiological conditions, cells were plated on laminin 521 in all of those experiments. As some effects of Lmx1b knock-out might only be visible during cell stress and not in the steady state, many experiments were performed with both spreading and also full-grown, steady state podocytes. The knock-out of Lmx1b led to an increased F actin staining in both spreading and steady state podocytes. Moreover, the circularity and roundness in the late phase of spreading and also at steady state were increased. The cell area of spreading podocytes and also the cell size measured by forward light scatter in FACS experiments was independent of Lmx1b knock-out, but the cell area of Lmx1b-deficient steady state podocytes was markedly increased. Thus, primary Lmx1b knock-out podocytes are flatter and rounder and contain more actin fibers. Untreated podocytes revealed similar random movement velocities and spreading rates independent of Lmx1b expression. Treatment of podocytes with cytochalasin D induced cell shrinkage at similar rates and accumulation of short actin fibers at spots near the nucleus and at the base of small cell extensions. Removal of cytochalasin D, in turn, led to cell spreading, which was reduced in the absence of Lmx1b. The cytoskeleton remained atypically organized two hours after wash-out of cytochalasin D in knock-out cells as well as wild-type controls. The different observations of cell spreading with or without prior cytochalasin D treatment can be explained by different initial states of the actin cytoskeleton and focal adhesions at the beginning of the experiment. Thus, only some actin-dependent dynamic processes are influenced by Lmx1b and its target genes.
As the impact of Lmx1b on the actin cytoskeleton was obvious, one of the main goals was to identify the signaling pathways involved. Therefore, two different strategies were carried out. One possibility was to examine the activities of proteins involved in signaling cascades. This was achieved either by specific binding of activated proteins to effectors or by analyzing the amount of phosphorylation utilizing specific antibodies. The other possibility was the investigation of the podocyte spreading after the removal of cytochalasin D in the presence of inhibitors blocking specific signaling proteins. In case the inhibitor would block a dysregulated protein, the spreading curves of knock-out and wild-type podocytes were expected to converge. The Rho GTPases are key actin regulators (Sadok and Marshall, 2014) and therefore, were subject of investigation. The activity of RhoA and Cdc42 was significantly reduced in glomerular lysates of podocyte-specific Lmx1b knock-out mice, while the activity of Rac1 was equal to controls. Additionally, the phosphorylation of the myosin light chain and thereby activation of myosin-2 was decreased after de novo expression of LMX1B in a human podocyte cell line (hPCL). By the use of inhibitors in spreading experiments, LIMK but not ROCK could be identified to be dysregulated in primary murine Lmx1b knock-out podocytes. Many of the actin cytoskeleton related dysregulations of podocytes can be explained by the reduced activity of Cdc42, but not RhoA, including increased circularity and roundness, decreased spreading after removal of cytochalasin D and the dysregulation of LIMK. Nevertheless, further investigation of the Cdc42 pathway is required to prove this connection.
As Lmx1b knock-out podocytes revealed increased adhesion to laminin-111 (Burghardt et al., 2013), the potential role of focal adhesions downstream of Lmx1b was investigated. Moreover, outside-in signaling at focal adhesions impacts the actin cytoskeleton. Focal adhesions are accumulations of a multitude of proteins, which anchor cells to the extracellular matrix and establish a mechanical as well as a signaling link to the actin cytoskeleton. Transmembrane integrins are the most important proteins within focal adhesions, and α3β1-integrin is the most abundant integrin in podocytes (Sachs and Sonnenberg, 2013). Staining with an antibody specific for active β1-integrin revealed no differences between Lmx1b knock-out and wild-type control podocytes by confocal microscopy. On the other hand, a slightly increased activation of β1-integrin in knock-out podocytes was detectable by flow cytometry. The amount of total β1-integrin in podocytes and also the activity of β1-integrin in other glomerular cells remained unchanged, thus indicating primary intracellular rather than secondary extracellular causes for increased β1-integrin activation in podocytes. Further investigations regarding the pathway of increased integrin activation are of interest, for instance, talin or kindlin-2 expression and localization (Askari et al., 2009) as well as measurement of the mechanical tension at focal adhesions with FRET-based biosensors (Grashoff et al., 2010).
Transgelin is an actin-binding protein previously shown to be highly expressed in Lmx1b-deficient podocytes, but not in wild-type controls. Transgelin is localized to the cell cortex in both spreading and steady state podocytes, but colocalization with actin bundles was only observed in steady state podocytes. Surprisingly, podocyte outgrowth led to transgelin expression in wild-type controls, although to a lower extent when compared to steady state Lmx1b knock-out podocytes. To address the impact of de novo transgelin expression on the podocyte and on renal health, a double Sm22 and Lmx1b (podocyte-specific) knock-out mouse line was created. Investigation of the survival and proteinuria of those mice revealed a strong dependence on the genetic background, but also an increased percentage of mice with prolonged lifetime and delayed onset of proteinuria compared to podocyte-specific Lmx1b knock-out control mice. A deeper analysis of double knock-out mice 8 days postnatally, on the other hand, demonstrated worse proteinuria of most mice, except for one animal without any pathological phenotype. No influence of additional Sm22 knock-out on kidney histology, kidney ultrastructure, filtration slit density and glomerular phalloidin staining could be revealed. The body weight of some, but not all, double knock-out mice was reduced compared to controls. Supported by a previous report (Marshall et al., 2011), this led to the assumption of beneficial aspects of transgelin expression in early podocyte damage and detrimental effects in the later disease progression.
Translation of the abstract (German)
Mutationen des Transkriptionsfaktors LMX1B verursachen die Erbkrankheit Nagel-Patella-Syndrom, die bei einigen Patienten zu Nierenschäden führt (Witzgall, 2017). Innerhalb der Niere wird LMX1B ausschließlich in Podozyten exprimiert und spielt dabei eine essentielle Rolle sowohl in der Zellentwicklung als auch in der Instandhaltung. Frühere Lmx1b knock-out Studien zeigten eine Dysregulation der ...
Translation of the abstract (German)
Mutationen des Transkriptionsfaktors LMX1B verursachen die Erbkrankheit Nagel-Patella-Syndrom, die bei einigen Patienten zu Nierenschäden führt (Witzgall, 2017). Innerhalb der Niere wird LMX1B ausschließlich in Podozyten exprimiert und spielt dabei eine essentielle Rolle sowohl in der Zellentwicklung als auch in der Instandhaltung. Frühere Lmx1b knock-out Studien zeigten eine Dysregulation der Gene Abra, Arl4c und Sm22 und des Aktin-Zytoskeletts (Burghardt et al., 2013; Stepanova, 2016). Aus diesem Grund war das Hauptziel dieser Arbeit eine Verbindung zwischen den Zielgenen und dem dysregulierten Aktin-Zytoskelett zu finden.
Durch Verwendung einer speziellen Mauslinie konnte ein Lmx1b knock-out spezifisch in den Podozyten adulter Tiere induziert werden, was gleichzeitig zu einer Expression eines grünen Fluorophors führte. Western Blots der Lysate grün fluoreszierender Podozyten bestätigte eine erhöhte Expression von Arl4c und Transgelin auf Proteinebene, während eine Erhöhung von Abra nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte.
Podozyten, die der oben genannten Mauslinie entstammen, wurden zudem auf Laminin-521 ausgesät, um möglichst physiologische Bedingungen für weitere Experimente zu schaffen. Lmx1b knock-out führte zu geringerer F-Aktin-Färbung in sowohl sich ausbreitenden als auch steady-state Podozyten. Des Weiteren war die Zellfläche im steady-state, aber nicht während des Ausbreitens der Zellen erhöht, während die Zellen gleichzeitig eine rundere Form zeigten. Da das Zellvolumen unverändert war, ergibt sich damit das Bild von flacheren, rundlicheren Zellen mit mehr F-Aktin-Fasern. Die ungerichtete Bewegung der Zellen war unverändert, ebenso die Ausbreitungsrate nach dem Aussäen. Durch Behandlung der Podozyten mit Cytochalasin D kam es zu einer Flächenabnahme, wobei die Abnahmegeschwindigkeit unverändert war im Vergleich zu den Kontrollen. Das F-Aktin akkumulierte in beiden Fällen in wenigen Bereichen. Nach Auswaschen von Cytochalasin D breiteten sich die Zellen wieder aus, wobei die Ausbreitungsrate in Lmx1b knock-out Zellen reduziert war. Die unterschiedlichen Ausbreitungsraten nach dem Aussäen bzw. nach Cytochalasin D Behandlung lassen sich durch verschiedene Zustände des Aktin-Zytoskeletts und der fokalen Kontakte bei Beginn der Experimente erklären.
Zur Identifizierung von Signalwegen, die eine Verbindung zwischen den Zielgenen und dem dysregulierten Aktin-Zytoskelett darstellen, wurden zwei Strategien verfolgt. Zum einen wurde die Aktivität bzw. Phosphorylierung wichtiger Aktin-Regulatoren überprüft. Dabei zeigte sich eine geringere Aktivität von RhoA und Cdc42 in Lmx1b knock-out Glomeruli. Ebenso war die Phosphorylierung und damit Aktivierung von MLC nach de novo LMX1B Expression in einer humanen Podozytenzelllinie (hPCL) verringert. Die zweite Strategie war der Einsatz von spezifischen Inhibitoren, deren Einfluss auf das Ausbreitungsverhalten von Podozyten nach Cytochalasin D Behandlung überprüft wurde. Führt die Hemmung eines Proteins zur Angleichung der Ausbreitungsraten zwischen knock-out und Kontrollen, so ist dieses Protein ein Bestandteil des dysregulierten Signalwegs. Auf diesem Weg konnte LIMK, aber nicht ROCK, als dysreguliert identifiziert werden. Zusammengenommen lassen sich fast alle der Beobachtungen durch eine geringere Aktivität von Cdc42 erklären, nicht aber mit einer geringeren Aktivität von RhoA.
In früheren Experimenten zeigte sich eine erhöhte Adhäsion von knock-out Podozyten auf Laminin-111 (Burghardt et al., 2013). Die Adhäsion wird von Integrinen als wichtigster Bestandteil von fokalen Kontakten vermittelt, und diese spielen auch eine übergeordnete Rolle in der Regulation des Aktin-Zytoskeletts. Das in Podozyten häufigste Integrin ist das α3b1-Integrin (Sachs und Sonnenberg, 2013). In FACS Studien zeigte sich eine leicht erhöhte Aktivität von β1-Intgrin in Lmx1b knock-out Podzyten, während die Gesamtmenge an β1-Integrin unverändert blieb. Da andere glomeruläre Zellen keine erhöhte Aktivität von β1-Integrin zeigten, ist ein sekundärer, durch extrazelluläre Stoffe vermittelter Effekt auszuschließen.
Transgelin ist ein Aktin-bindendes Protein, welches in gesunden Podozyten nicht, in Lmx1b knock-out Podozyten dagegen stark exprimiert wird. Transgelin lokalisierte am Zellrand sowohl von sich ausbreitenden als auch steady-state Podozyten, wogegen Kolokalisation mit Aktin-Fasern nur im steady-state auftrat. Überaschenderweise führte die Kultivierung der primären Podozyten abseits der Glomuli zu einer Expression von Transgelin auch in wild-typ Zellen, wobei diese etwas geringer war im Vergleich zum Lmx1b knock-out. Um den Einfluss der de novo Expression von Transgelin auf den Zustand und Leistungsfähigkeit der Nieren zu untersuchen, wurde eine Mauslinie mit doppelten Lmx1b und Sm22 knock-out gezüchtet. Untersuchungen der Überlebenskurven und der Proteinurie zeigten eine starke Abhängigkeit der Schädigungen vom genetischen Hintergrund der Tiere. Dennoch gab es mehr Tiere mit erhöhter Lebenserwartung bei einem doppelten knock-out im Vergleich zu Tieren mit lediglich Lmx1b knock-out. Weitere Analysen von 8 Tage alten Tieren zeigte eine Verschlechterung der Proteinurie und des Körpergewichts bei doppeltem knock-out im Vergleich zu Kontrolltieren, mit der Ausnahme von einem Tier, das überhaupt keine Schädigungen zeigte. Die Histologie der Niere, die Ultrastruktur der Filtrationsbarriere und Anzahl der Filtrationsschlitze zeigte keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Im Zusammenspiel mit den Daten einer früheren Publikation (Marshall et al. 2011), führt das zu der Annahme, dass Transgelin zunächst positive Effekte auf geschädigte Podozyten besitzt, sich aber im späteren Verlauf negativ auswirkt.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 17:48
Owner only: item control page
Download Statistics