| License: Creative Commons Attribution 4.0 (12MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-443811
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.44381
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 14 January 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Günther Bernhardt |
| Date of exam: | 9 December 2020 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | ABCG2 transporter, inhibitors, water solubility, stability |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 44381 |
Abstract (English)
ATP-binding cassette (ABC) transporters are gatekeepers at all major tissue barriers, e.g. the intestinal barrier or the blood-brain barrier (BBB). On one hand, these proteins extrude endogenous substrates and on the other hand, they protect cells against the entry of numerous xenobiotics, including a variety of drugs such as anticancer agents or neuropharmaceuticals. The three main drug ...
Abstract (English)
ATP-binding cassette (ABC) transporters are gatekeepers at all major tissue barriers, e.g. the intestinal barrier or the blood-brain barrier (BBB). On one hand, these proteins extrude endogenous substrates and on the other hand, they protect cells against the entry of numerous xenobiotics, including a variety of drugs such as anticancer agents or neuropharmaceuticals. The three main drug transporters are ABCB1, ABCC1 and ABCG2, with ABCG2 being predominant at the human BBB. They constitute a severe impediment for the oral bioavailability and brain penetration of drugs, and confer multidrug resistance (MDR) to cancer cells. Thus, inhibitors of ABCG2 are required as molecular tools for examinations on the patho(physiological) role of this transporter and as potential drugs to overcome tissue barriers (especially the BBB) and MDR in cancer.
So far, the discovery of ABCG2 inhibitors had largely been driven by potency, while drug-like properties – imperative for application in vivo – had been overlooked. Moreover, the mechanism of transport inhibition had been enigmatic. Therefore, the present thesis aimed at creating novel ABCG2 inhibitors with improved drug-like properties, especially stability in blood plasma and water solubility, and at elucidating the underlying transport inhibition mechanism.
Tariquidar analogs had been described as potent and selective ABCG2 inhibitors. Yet, their susceptibility to hydrolysis limited their applicability in vivo. Chapter 2 of this thesis comprises the synthesis (performed by Prof. König’s group) and characterization (performed by our group, including the author of this thesis) of new tariquidar-related inhibitors, obtained by bioisosteric replacement of the labile moieties in the previous tariquidar analog UR-ME22-1. CuAAC (“click” reaction) gave access to a triazole core as a substitute for the labile amide group and the unstable ester moiety was replaced by acyl groups. An HPLC assay proved enhanced stability in blood plasma. Compounds UR-MB108 and UR-MB136 inhibited ABCG2 in a Hoechst 33342 transport assay with an IC50 value of about 80 nM, thus belong to the most potent ABCG2 inhibitors described so far. Compound UR-MB108 was highly selective for ABCG2, while its PEGylated analog UR-MB136 showed some potency at ABCB1. Both UR-MB108 and UR-MB136 produced an ABCG2 ATPase-depressing effect, which is in agreement with a precedent cryo-EM study identifying UR MB136 as an ATPase inhibitor that exerts its effect via locking the inward-facing conformation of ABCG2. As reference substances, compounds UR-MB108 and UR-MB136 allow additional mechanistic studies on ABCG2 inhibition. Stable in blood plasma, they are also applicable in vivo.
Chapter 3 of this thesis is focused on water solubility, which is an indispensable prerequisite for all bioactive compounds – seemingly trivial, however often underestimated. Many drug development failures have been attributed to poor aqueous solubility. ABCG2 inhibitors are especially prone to be insoluble since they have to address the extremely large and hydrophobic multidrug binding site in ABCG2. A case in point is UR-MB108, which showed high potency (79 nM), but very low aqueous solubility (78 nM). To discover novel potent ABCG2 inhibitors with improved solubility, a fragment-based approach was pursued. Substructures of UR-MB108 were optimized and the fragments ‘enlarged’ to obtain inhibitors, in part supported by molecular docking studies. Syntheses were achieved, i.a., via Sonogashira coupling, click chemistry and amide coupling. A kinetic solubility assay revealed that UR-MB108 and most of the new inhibitors did not precipitate during the short time period of the applied biological assays. The solubility of the compounds in aqueous media at equilibrium was investigated in a thermodynamic solubility assay, where UR-Ant116, UR-Ant121, UR-Ant131 and UR-Ant132 excelled with solubilities between 1 µM and 1.5 µM – an up to 19-fold improvement compared to UR-MB108. Moreover, these novel N-phenyl-chromone-2-carboxamides inhibited ABCG2 in a Hoechst 33342 transport assay with potencies in the low three-digit nanomolar range, reversed MDR in ABCG2-overexpressing cancer cells, were non-toxic and proved stable in blood plasma. Altogether, the aforementioned compounds are attractive candidates for in vivo studies and in vitro assays requiring long-term incubation, both needing sufficient solubility at equilibrium. UR-Ant121 and UR-Ant132 were highly ABCG2-selective, a precondition for developing PET tracers. The triple ABCB1/C1/G2 inhibitor UR-Ant116 qualifies for potential therapeutic applications, given the concerted role of the three transporter subtypes at many tissue barriers, e.g. the BBB.
Taken together, this thesis provides ABCG2 inhibitors that are potent and effective as well as water-soluble, stable in blood plasma and nontoxic, which may be of interest as molecular biological tools and as drugs for patients with cancer or brain disorders.
Translation of the abstract (German)
ATP-binding cassette (ABC) Transporter sind Pförtner an allen wichtigen Gewebebarrieren, wie der Darmbarriere oder der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Einerseits extrudieren diese Proteine endogene Substrate, andererseits schützen sie Zellen vor zahlreichen Xenobiotika, darunter etliche Arzneistoffe wie Krebsmedikamente oder Neuropharmaka. Die drei wichtigsten Arzneistofftransporter sind ABCB1, ABCC1 ...
Translation of the abstract (German)
ATP-binding cassette (ABC) Transporter sind Pförtner an allen wichtigen Gewebebarrieren, wie der Darmbarriere oder der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Einerseits extrudieren diese Proteine endogene Substrate, andererseits schützen sie Zellen vor zahlreichen Xenobiotika, darunter etliche Arzneistoffe wie Krebsmedikamente oder Neuropharmaka. Die drei wichtigsten Arzneistofftransporter sind ABCB1, ABCC1 und ABCG2, wobei ABCG2 an der menschlichen BHS überwiegt. Sie begrenzen die orale Bioverfügbarkeit und die Hirnpenetration von Medikamenten und verleihen Krebszellen Multidrug-Resistenz (MDR). Daher werden ABCG2 Inhibitoren als molekulare Werkzeuge zur Untersuchung der patho(physiologischen) Rolle dieses Transporters und als potenzielle Medikamente zur Überwindung von Gewebebarrieren (insbesondere der BHS) und MDR bei Krebs benötigt.
Bisher fokussierte sich die Entwicklung von ABCG2-Inhibitoren auf Wirkstärke, während drug-like Eigenschaften – zwingend notwendig für die Anwendung in vivo – vernachlässigt wurden. Darüber hinaus blieb der Mechanismus der Transporthemmung rätselhaft. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, neuartige ABCG2-Inhibitoren mit verbesserten drug-like Eigenschaften, insbesondere Stabilität im Blutplasma und Wasserlöslichkeit, zu entwickeln und den zugrunde liegenden Mechanismus der Transporthemmung aufzuklären.
Tariquidar-Analoga wurden als potente und selektive ABCG2-Inhibitoren beschrieben, jedoch begrenzte ihre Hydrolyseanfälligkeit ihre Anwendbarkeit in vivo. Kapitel 2 dieser Arbeit umfasst die Synthese (durchgeführt von Prof. König´s Gruppe) und Charakterisierung (durchgeführt von unserer Gruppe, einschließlich der Autorin dieser Arbeit) von neuen Tariquidar-verwandten Inhibitoren, die durch bioisosterischen Austausch der labilen Gruppen im vorherigem Tariquidar-Analog UR-ME22-1 erhalten wurden. CuAAC ("Click"-Reaktion) ermöglichte den Zugang zu einem Triazolkern als Ersatz für die labile Amidgruppe. Acylgruppen ersetzten die instabile Estergruppe. Ein HPLC-Assay belegte erhöhte Stabilität im Blutplasma. Die Verbindungen UR-MB108 und UR-MB136 hemmten ABCG2 in einem Hoechst 33342-Transport-Assay mit einem IC50-Wert von etwa 80 nM und gehören damit zu den potentesten bisher beschriebenen ABCG2-Inhibitoren. Die Verbindung UR-MB108 war hochselektiv für ABCG2, während ihr PEGyliertes Analogon UR-MB136 eine gewisse Potenz bei ABCB1 zeigte. Sowohl UR-MB108 als auch UR-MB136 erzeugten eine ABCG2-ATPase-hemmende Wirkung. Dies stimmt mit einer vorherigen cryo-EM-Studie überein, die UR-MB136 als ATPase-Inhibitor identifizierte, der seine Wirkung über die Arretierung der nach innen gerichteten Konformation von ABCG2 ausübt. Als Referenzsubstanzen ermöglichen die Verbindungen UR-MB108 und UR-MB136 weitere mechanistische Studien zur ABCG2-Inhibition. Durch ihre Stabilität im Blutplasma sind sie auch in vivo einsetzbar.
Kapitel 3 dieser Arbeit befasst sich mit Wasserlöslichkeit, eine unabdingbare aber oft unterschätzte Voraussetzung aller bioaktiven Substanzen. Viele Misserfolge in der Medikamentenentwicklung wurden auf schlechte Wasserlöslichkeit zurückgeführt. ABCG2-Inhibitoren sind besonders anfällig für Unlöslichkeit, da sie die extrem große und hydrophobe Multidrug-Bindungsstelle in ABCG2 adressieren müssen. UR-MB108, z. B., zeigte hohe Potenz (79 nM), aber sehr geringe Wasserlöslichkeit (78 nM). Um neue potente ABCG2-Inhibitoren mit verbesserter Löslichkeit zu entdecken, wurde ein Fragment-basierter Ansatz verfolgt. Substrukturen von UR-MB108 wurden optimiert und die Fragmente zu Inhibitoren "vergrößert", teilweise unterstützt durch molekulare Docking-Studien. Die Synthese wurde u.a. durch Sonogashira-Kopplung, Click-Chemie und Amid-Kopplung erreicht. Ein kinetischer Löslichkeits-Assay zeigte, dass UR-MB108 und die meisten neuen Inhibitoren während der kurzen Zeitspanne der angewandten biologischen Assays nicht ausfielen. Die Wasserlöslichkeit der Verbindungen im Gleichgewicht wurde in einem thermodynamischen Löslichkeits-Assay untersucht, wobei UR-Ant116, UR-Ant121, UR-Ant131 und UR-Ant132 mit Löslichkeiten zwischen 1 µM und 1,5 µM herausragten – eine bis zu 19-fache Verbesserung im Vergleich zu UR-MB108. Zudem hemmten diese neuartigen N-Phenyl-chromon-2-carboxamide ABCG2 in einem Hoechst-333342-Transport-Assay mit Potenzen im niedrigen dreistelligen nanomolaren Bereich, kehrten die MDR in ABCG2-überexprimierenden Krebszellen um, waren nicht toxisch und erwiesen sich im Blutplasma als stabil. Insgesamt sind die genannten Verbindungen attraktive Kandidaten für in-vivo-Studien und für in-vitro-Assays mit langen Inkubationszeiten, da beide ausreichende Löslichkeit im Gleichgewicht benötigen. UR-Ant121 und UR-Ant132 waren hochgradig ABCG2-selektiv, eine Voraussetzung für PET-Tracer. Der dreifache ABCB1/C1/G2-Inhibitor UR-Ant116 eignet sich für potenzielle therapeutische Anwendungen, da die drei Transporter-Subtypen an vielen Gewebebarrieren, z. B. der BHS, eine konzertierte Rolle spielen.
Metadata last modified: 14 Jan 2021 08:58
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