| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (12MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-493774
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.49377
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 25 Juli 2022 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Frank Sprenger |
| Tag der Prüfung: | 23 Juli 2021 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control > Prof. Dr. Frank Sprenger |
| Stichwörter / Keywords: | Regulator of Cyclin A1 (Rca1), Anaphase-Promoting-Complex (APC/C), Cell cycle Regulation, Drosophila, Flowcytometry, |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 49377 |
Zusammenfassung (Englisch)
The cell division cycle is regulated by the timely degradation of cell cycle regulators leading to an abrupt and irreversible change of protein concentration. At the centre of this system are E3 ubiquitin ligases that mark substrates for degradation by the 26S proteasome at precise time points during cell cycle progression. The anaphase promoting complex or cyclosome (APC/C) is a multi-subunit E3 ...
Zusammenfassung (Englisch)
The cell division cycle is regulated by the timely degradation of cell cycle regulators leading to an abrupt and irreversible change of protein concentration. At the centre of this system are E3 ubiquitin ligases that mark substrates for degradation by the 26S proteasome at precise time points during cell cycle progression. The anaphase promoting complex or cyclosome (APC/C) is a multi-subunit E3 ubiquitin ligase that targets a multitude of different proteins during mitosis and G1-phase in a strict order, thereby triggering mitotic events. APC/C activity is supressed during S- and G2-phase through inhibitory phosphorylation of the co-activator subunit Cdh1/Fzr and the simultaneous action of potent APC/C inhibitor proteins, allowing re-accumulation of mitotic cyclins. In Drosophila, Regulator of Cyclin A1 (Rca1) inhibits APC/CFzr in S- and G2-phase, whereas its degradation during G1-phase submits APC/C-Fzr activity required for the establishment and maintenance of G1-phase. This thesis focuses on the degradation pathway, inhibitory function, and regulation of Rca1 during cell cycle progression. Initially, Rca1 degradation during G1-phase and the involved E3 ubiquitin ligase were investigated. There-fore, an in vivo high-throughput method to analyze the stability of selected proteins during the cell cycle in single cells using flow cytometry of asynchronous cell populations in Drosophila S2R+ cells was established and verified using known substrates of the APC/C and CRL4Cdt2 ligases. Using this “relative protein stability” (RPS) system, it was shown that Rca1 is degraded with similar kinetics like the APC/C target Geminin and that its degradation depends on APC/C-Fzr activity. Furthermore, several APC/C degrons and the C-terminal RL-tail were found to confer Rca1 destruction, demonstrating that Rca1 also constitutes an APC/C substrate besides being an APC/C inhibitor. Next, the functional domains of Rca1 mediating APC/C inhibition were characterized. Rca1 shares a similar arrangement of protein do-mains like the vertebrate APC/C inhibitor Emi1, which other than canonical pseudosubstrate inhibitors supresses APC/C activity mainly through regulation of E2 binding and only to a lesser extent by blocking substrate recruitment. Using an in vivo APC/C activity assay, several protein domains including a C-terminal KEN- and D-box, a ZBR, and a RL-tail that confer APC/C inhibition by Rca1 were identified. The requirement of similar protein domains for sufficient APC/C inhibition like Emi1 suggests that Rca1 also restricts APC/C activity by a more sophisticated mechanism than just acting as a pseudosubstrate competitive inhibitor. Finally, the molecular mechanisms turning Rca1 from an APC/C inhibitor to substrate were explored. It could be demonstrated that phosphorylation of Rca1 at the C-terminal inhibitory domains increased its ability to inhibit the APC/C and in parallel phosphorylation of N-terminal residues caused a stabilization of Rca1. Just as phosphorylation, nuclear localization of Rca1 was shown to be essential for sufficient degradation during G1-phase. Additionally, a phospho-dependent interaction with 14-3-3 was discovered that is probably involved in Rca1 sequestration by enhancing its nuclear export, thereby providing a first hint linking Rca1 phosphorylation and localization as potential regulatory mechanisms converting Rca1 from an APC/C inhibitor to substrate.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der durch E3 -Ubiquitin -Ligasen vermittelte proteolytische Abbau von Proteinen zu genau definierten Zeitpunkten ist ein zentraler Bestandteil der Regulation des Zellzyklus. Der APC/C-Komplex (Anaphase-Promoting-Complex/Cyclosome) ist verantwortlich für den strikt geregelten Abbau einer Vielfalt von regulatorischen Proteinen während der Mitose und der G1-Phase. Eine Inaktivierung des APC/C in der ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der durch E3 -Ubiquitin -Ligasen vermittelte proteolytische Abbau von Proteinen zu genau definierten Zeitpunkten ist ein zentraler Bestandteil der Regulation des Zellzyklus. Der APC/C-Komplex (Anaphase-Promoting-Complex/Cyclosome) ist verantwortlich für den strikt geregelten Abbau einer Vielfalt von regulatorischen Proteinen während der Mitose und der G1-Phase. Eine Inaktivierung des APC/C in der S- und G2-Phase, die eine erneute Akkumulierung der für die Mitose benötigten Proteine ermöglicht, erfolgt durch inhibitorische Phosphorylierung des Co-Aktivators Cdh1/Fzr und die Interaktion mit spezifischen APC/C- Inhibitoren. In Drosophila, fungiert das Protein „Regulator of Cyclin A1“ (Rca1) als spezifischer APC/C -Inhibitor, welches selbst während der G1-Phase abgebaut wird und somit eine vollständige Aktivierung des APC/C-Komplexes ermöglicht. Im Fokus dieser Dissertation lag es den Abbau von Rca1 in der G1-Phase, den inhibitorischen Mechanismus und die Regulation von Rca1 im Verlauf des Zellzyklus zu untersuchen. Um den Abbau von Proteinen in Drosophila Zellkulturzellen untersuchen zu können, wurde ein Durchflusszytometrie basierte Hochdurchsatzmethode zur Analyse von relativen Proteinstabilitäten in asynchronen Zellpopulationen etabliert. Mit dem als „Relative Protein Stability“ (RPS) System bezeichneten Verfahren konnte gezeigt werden, dass der Abbau von Rca1 in der G1-Phase dem Abbau des APC/C-Substrates Geminin ähnelt. Im weiteren Verlauf konnte aufgezeigt werden, dass die Degradation von Rca1 von der Aktivität des APC/C abhängig ist und durch spezifische APC/C-Erkennungssequenzen und einer weiteren RL-tail Domäne vermittelt wird. Somit handelt es sich bei Rca1 sowohl um einen APC/C-Inhibitor als auch -Substrat.
Im weiteren Verlauf konnten mittels eines in vivo APC/C- Aktivitäts-Assay mehrere für die APC/C- Inhibition notwendige C-terminale Proteindomänen identifiziert werden. Hierbei handelte es sich, ähnlich zum Vertebraten APC/C Inhibitor Emi1, unter anderem um ein KEN-box und D-box Degron, eine Zink-Binde-Region (ZBR) und eine RL-tail Domäne. Die Verwendung ähnlicher struktureller Domänen lässt auf einen vergleichbaren inhibitorischen Mechanismus für Rca1 schließen und widerspricht der bisherigen Annahme einer hauptsächlichen Inhibition als Pseudosubstrat.
Da Rca1 abhängig von der entsprechenden Phase des Zellzyklus als ein APC/C Inhibitor oder Substrat fungiert, wurden verschiedene regulatorische Mechanismen für die Funktion und den Abbau von Rca1 untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von Rca1 in der C-terminalen Region einen verstärkenden Effekt auf die APC/C Inhibition hat und Rca1 gleichzeitig durch N-terminale Phosphorylierung stabilisiert wird. Auch die Lokalisation von Rca1 in den Zellkern war essenziell für die Degradation von Rca1 während der G1-Phase. In weiteren Experimenten wurde eine bisher unbekannte phosphorylierungs-abhängige Interaktion mit einem 14-3-3 Protein entdeckt, die den Export von Rca1 aus dem Zellkern in das Zytoplasma verstärkt. Diese Ergebnisse geben erste Hinweise auf einen komplexen Regulationsmechanismus von Rca1, der auf synergetischen Effekten von Veränderungen der Phosphorylierung und zellulärer Lokalisation von Rca1 beruhen könnte.
Metadaten zuletzt geändert: 27 Jul 2022 04:24
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