| License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 PDF - Submitted Version Dissertation Pierre Pütz 2021 (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-508528
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.50852
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 27 September 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener and Prof. Dr. Cornelia Kasper and Prof. Dr. Rainer Müller |
| Date of exam: | 27 September 2021 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | Impedance Spectroscopy, Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS), Non-Invasive, Time-Resolved, Tissue Model, Laser-Scribed Graphene (LSG) |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 50852 |
Abstract (English)
The preclinical testing of active substances is routinely performed first on living cells in vitro and later on, tests are done on living animals. There still exists a wide-ranging gap between two-dimensional cell monolayers in vitro and animal models as a complex organism. Existing three-dimensional tissue models either do not yield time-dependent information on the cell reaction or only provide ...
Abstract (English)
The preclinical testing of active substances is routinely performed first on living cells in vitro and later on, tests are done on living animals. There still exists a wide-ranging gap between two-dimensional cell monolayers in vitro and animal models as a complex organism. Existing three-dimensional tissue models either do not yield time-dependent information on the cell reaction or only provide an integral response of the entire tissue. Thus, the aim of this work was the development of a three-dimensional in vitro model of mammalian tissue with integrated thin film electrodes as required for a time-resolved impedimetric readout of the individual cell layers. The concept was built upon preliminary studies and knowledge which had already been acquired in the lab for analyzing two cell layers on opposing sides of a permeable polymer substrate. In this thesis, this basic concept was adapted to a more flexible architecture that allows studying a variable number of cell layers in close proximity to each other, mimicking 3D tissue. Therefore, three different electrode layouts – (i) two rectangular, equally-sized electrodes, (ii) an interdigitated finger electrode layout and (iii) a small centrosymmetrical working electrode in combination with a significantly larger counter electrode – were compared to each other and their compatibility with respect to the project requirements was investigated. The distinction of different adherently growing cell types on the electrode layouts was unambiguously possible according to the recorded impedance and phase spectra. Furthermore, the extraction of cell-specific ECIS® parameters from the impedance spectra yielded anticipated parameter values compatible with the available literature. Advantages of the first layout lay in the field of rapid prototyping because of the material-efficient and geometrically simple layout. The second, interdigitating finger electrode layout, was able to provide a more representative integral signal of the entire cell population due to the larger active electrode area. The last electrode layout with the centrosymmetrical working electrode was the only one allowing for an effective counter electrode insulation which proved to be crucial in the development process. The reproducible generation of a one-sided gold-film electrode layout on a permeable polymer membrane was subsequently optimized with regard to sputter conditions, the material stability of the substrate polymer and the homogeneity of the gold coating. Test measurements with selected cell lines were performed on membranes with electrodes prepared on the cell-facing side only, after a cell cultivation-suitable receptacle had been established on each side to define the growth area as well as a reproducible way of connecting the electrodes to the hardware. During these measurements the impact of the backside electrolyte current became obvious which provided an alternative current pathway bypassing the confluent cell layer grown to the front side. Thus, the cell layer became invisible to the impedance measurements. Due to the backside electrolyte impact, an efficient insulation of the counter electrode on the reverse side was indispensable and could eventually be achieved by using a self-adhesive lamination foil. The insulation was confined to the area of the counter electrode by drilling a central opening in the lamination foil in order to maintain the permeability of the working electrode. After coating the lamination foil with a thin gold layer similar to the permeable polymer membrane, the lamination foil could be used as an additional counter electrode for the detection of living cells on the reverse side of the polymer membrane. This way, the very same working electrode could be used to detect cells on the front- and reverse side by sequentially contacting it first against the counter electrode on the filter and afterwards against the gold-coated lamination foil, respectively. An extensive investigation of a suitable dimension of the hole in the insulating lamination foil eventually allowed for an individual and independent addressing of the cell layers growing on both sides of the filter membrane and thus also to a successful transfer of the three-electrode setup to a stackable system of multiple permeable supports. The establishment of a functional and reproducible cell cultivation process on both sides of the permeable support was achieved with the help of specially designed cultivation chambers and a corresponding measurement chamber in which two of the final cell-covered permeable supports could be stacked next to each other. Mass transport within the measurement chamber alone was documented by a cell-free optical dye dilution assay as well as the impedimetric detection of a redox probe. The results thereof, including the experimentally determined total flux from the diffusion studies, were confirmed via simulations using the finite element method. Furthermore, frequency- and time-resolved proof-of-concept studies with epithelial cells exhibiting cell-type specific barrier properties have not only shown that an individual monitoring of each of the four cell layers is possible; distinct measurements with reduced buffer conductivity and the addition of model substances e.g. cytochalasin D and tert-butyl hydroperoxide also provoked specific response profiles validated by independent ECIS® measurements on impermeable substrates and zellZscope measurements with permeable filter inserts.
In summary, the novel measurement system is capable of mimicking a three-dimensional tissue model by providing a physiological environment for each cell with neighboring cells in all three dimensions. At the same time, each single cell layer can be monitored individually, non-invasively and in a time-resolved manner by using this new biotechnological hybrid. The chamber material was chosen to consist of tempered polycarbonate which is extremely robust and therefore not only reusable but also suitable for frequent ethanol-sterilization. Due to the separate cultivation and measurement of the cells on the permeable supports, these steps can be performed in parallel. Thus, cell proliferation, adhesion and spreading processes can be directly monitored in the cultivation chambers and experiments with multiple permeable supports stacked next to each other – which all have confluent cell monolayers grown to each side – can be performed in the measurement chambers. Moreover, thanks to the modular setup of the measurement chamber, the number of permeable supports which are stacked therein, can be scaled up easily and the process is equally suited for all cell types as long as they grow adherently. This way, data of a cell reaction upon the reversible or irreversible external stimulation can be collected in a real-time and non-invasive manner and diffusion processes across multiple layers of tissue become accessible with the direct information from each layer. Last but not least, different cell types can be combined to yield organ-on-a-chip approaches in order to test the effectiveness or side effects of active substances.
Parallel to the development of the novel three-dimensional measurement setup, the new and promising electrode material laser-scribed graphene (LSG) was investigated with respect to the applicability as an alternative electrode material in cell-based assays. Thus, the LSG material was compared to the established gold standard by frequency- and time-resolved impedance data. Due to the rough topography and consequently large surface of LSG, a 25-fold higher interface capacitance was found for the same electrode geometry compared to gold which allowed for a better separation of the electrode- and cell-specific dispersions in the impedance spectrum. Because of this significantly higher membrane capacitance it is assumed that, in contrast to gold electrodes, it would still be possible to detect the presence of cell types with extraordinarily high membrane capacitances. An excellent biocompatibility of the LSG material was proven according to fluorescence cell stainings with subsequent microscopic evaluation as well as extensive investigations via impedance spectroscopy.
Translation of the abstract (German)
Die präklinische Testphase von Wirkstoffen wird routinemäßig zuerst an lebenden Zellen in vitro und später an lebenden Versuchstieren durchgeführt. Der Schritt von zweidimensionalen Zellmonolagen in vitro hin zu lebenden Versuchstieren als einem komplexen Organismus ist weiterhin sehr groß, da bestehende dreidimensionale Gewebemodelle entweder keine zeitaufgelöste Informationen über die ...
Translation of the abstract (German)
Die präklinische Testphase von Wirkstoffen wird routinemäßig zuerst an lebenden Zellen in vitro und später an lebenden Versuchstieren durchgeführt. Der Schritt von zweidimensionalen Zellmonolagen in vitro hin zu lebenden Versuchstieren als einem komplexen Organismus ist weiterhin sehr groß, da bestehende dreidimensionale Gewebemodelle entweder keine zeitaufgelöste Informationen über die Zellreaktionen liefern können, oder aber nur ein integrales Signal des gesamten Gewebemodells. Deswegen war das Ziel der vorliegenden Arbeit die vollständige Entwicklung eines dreidimensionalen in vitro Gewebe-Modells, welches Dünnfilmelektroden für die impedanzbasierte Auslesung bereits von vorne herein beinhaltet. Das Konzept baute auf bereits erworbenen Kenntnissen und vorbereitenden Studien innerhalb des Arbeitskreises auf, anhand derer es möglich war, zwei Zelllagen auf beiden Seiten einer permeablen Polymermembran zu analysieren. In dieser Arbeit wurde das grundlegende Konzept weiterentwickelt und an einen flexibleren Aufbau angepasst, wodurch eine variable Anzahl von Zelllagen zu einem 3D Gewebemodell zusammengesetzt werden können. Dazu wurden zuerst drei verschiedene Elektrodenlayouts – (i) zwei rechteckige, gleich große Elektroden sowie (ii) interdigitierende Elektrodenfinger und (iii) eine kleine, zentrosymmetrische Arbeitselektrode in Kombination mit einer deutlich größeren Gegenelektrode – miteinander verglichen und auf deren Kompatibilität in Hinblick auf das Projektziel untersucht. Die Unterscheidung von verschiedenen Zelltypen, welche adhärent auf den verschiedenen Elektrodenlayouts wuchsen, war anhand der Impedanz- und Phasenspektren auf allen Elektrodenlayouts zweifelsfrei möglich und auch die aus den Spektren bestimmten, zellspezifischen Parameter entsprachen in allen Fällen den Erwartungen und waren mit der einschlägigen Literatur kompatibel. Die Vorteile lagen im Falle des ersten Layouts im Bereich des rapid prototypings, da es sich um ein materialsparendes, geometrisch einfaches Layout handelte. Das zweite, interdigitierende Layout, ermöglichte es durch die vergleichsweise große Fläche, einen aussagekräftigeren Querschnitt der gesamten Zellpopulation zu erhalten und das dritte, zentrosymmetrische Layout bot als einziges die Möglichkeit einer effizienten Isolierung der Gegenelektrode, was sich im weiteren Verlauf als unabdingbar herauskristallisierte. Die reproduzierbare, einseitige Aufbringung des Elektrodenlayouts auf eine permeable Polymermembran wurde anschließend im Hinblick auf geeignete Sputterbedingungen, Formstabilität des Trägerpolymers und Homogenität der Beschichtung optimiert. Testmessungen mit ausgesuchten Zelllinien wurden an den zellseitig mit Elektroden funktionalisierten Polymermembranen durchgeführt, nachdem eine zur Kultivierung taugliche Berandung sowie eine reproduzierbare Kontaktierung an die Treiberelektronik etabliert wurden. Dabei trat das Problem des Rückseitenelektrolyten zu Tage, welcher einen alternativen Stromweg unter Umgehung der auf der Oberseite angewachsenen Zellschicht bot. Durch diesen alternativen Stromweg konnte die Zellschicht in der Impedanzmessung nicht detektiert werden und es stellte sich die eingangs erwähnte Isolierung der Gegenelektrode als notwendig heraus, welche letztendlich durch eine selbsthaftende Laminierungsfolie bewerkstelligt werden konnte. Dabei wurde nur die Fläche der Arbeitselektrode ausgespart, um die Permeabilität an dieser Stelle zu gewährleisten. Nach vorangegangener Belegung der Laminierungsfolie mit ebenfalls einer dünnen Goldschicht und einer entsprechenden externen Kontaktierung, konnte die Laminierungsfolie als zusätzliche Gegenelektrode genutzt werden, um auf der Rückseite der Sensormembran kultivierte Zellen zu adressieren. Dazu wurde ein und dieselbe Arbeitselektrode sequentiell erst gegen die Gegenelektrode auf dem Filter und anschließend gegen die goldbelegte Laminierungsfolie auf der Unterseite geschaltet. Eine ausführliche Untersuchung der geeigneten Abmessungen der Lochgröße in der isolierenden Laminierungsfolie erlaubten eine individuelle und unabhängige Adressierung der beiden Zellschichten auf Ober- und Unterseite und dadurch auch eine Übertragung auf ein schichtbares System aus mehreren permeablen Trägersubstraten. Die Etablierung einer routinemäßigen Kultivierung der Zellen auf beiden Seiten der permeablen Trägersubstraten gelang mit Hilfe von speziell entwickelten Kultivierungskammern und einer Messkammer, in der zwei der finalen permeablen Trägersubstrate hintereinander geschichtet werden konnten. Die Funktionstüchtigkeit der Kammer alleine wurde anhand von zellfreien optischen Farbverdünnungsassays sowie der impedimetrischen Detektion von Redoxsonden bewiesen. Die Ergebnisse, inklusive der experimentell bestimmten Teilchenstromdichte aus den Diffusionsstudien, konnten mit Hilfe von Simulationen basierend auf der Methode der finiten Elemente bestätigt werden. Des Weiteren haben Proof-of-concept-Messungen mit verschieden dichten Epithelzelllinien anhand von frequenz- und zeitaufgelösten Experimenten nicht nur gezeigt, dass ein individuelles Monitoring jeder der vier Zellschichten in dem System möglich ist und verschiedene Zelltypen eindeutig voneinander unterscheidbar sind, sondern spezielle Messungen mit veränderten Leitfähigkeiten und der Zugabe von Modellsubstanzen Cytochalasin D und tert-Butylhydroperoxid zeigten spezifische Reaktionsprofile, welche durch unabhängige ECIS® Experimente auf impermeablen Substraten und zellZscope Messungen mit permeablen Filtereinsätzen bestätigt werden konnten.
Zusammenfassend ist das neu entwickelte System in der Lage, ein dreidimensionales Gewebemodell zu imitieren, da eine physiologische Umgebung durch Nachbarzellen in allen drei Dimensionen für jede einzelne Zelle gewährleistet wird. Gleichzeitig kann in dem neuartigen Setup aber auch jede einzelne Zellschicht individuell, zeitaufgelöst und nichtinvasiv adressiert werden. Durch die Verwendung von robustem, getempertem Polycarbonat als Kammermaterial sind sowohl Kultivierungs- als auch Messkammern wiederverwendbar und können beliebig oft mit Ethanol sterilisiert werden. Durch die zeitlich und räumlich getrennte Vorkultivierung und anschließende Messung der Zellen auf den permeablen Trägersubstraten können mehrere Messungen parallel durchgeführt werden. Daten können sowohl während der Adhäsions- oder Proliferationsphase in den horizontalen Kultivierungskammern, oder auch hintereinander geschichtet in Form von mehreren konfluenten Zelllagen in der vertikalen Messkammer erhoben werden. Des Weiteren ist die Anzahl der permeablen Trägersubstrate in der Messkammer durch den modularen Aufbau derselben beliebig erweiterbar und für alle adhärenten Zelltypen gleichermaßen geeignet. Dadurch können Zellreaktionen nicht nur in Echtzeit und nicht-invasiv im Hinblick auf externe Stimulierungen erhoben werden, sondern auch Diffusionsvorgänge über mehrere Gewebeschichten werden dadurch zugänglich. Nicht zuletzt können so auch verschiedene Zelltypen zu Organ-on-a-chip-Ansätzen kombiniert werden, um dort gezielt Wirkstoffforschung zu betreiben.Parallel zur Entwicklung des neuen dreidimensionalen biotechnologischen Hybridsystems wurde das neuartige und vielversprechende Elektrodenmaterial laser-scribed graphene (LSG) auf dessen Eignung als alternatives Elektrodenmaterial für den Einsatz in zellbasierten Assays getestet und mit dem etablierten Referenzmaterial Gold verglichen. Es zeigte sich, dass LSG aufgrund der deutlich größeren Oberfläche bei gleichen Elektrodenabmessungen eine 25-fach größere Grenzflächenkapazität besitzt und dadurch die im Impedanzspektrum auftretenden elektroden- und zellspezifischen Dispersionen besser voneinander getrennt werden können. Gerade bei Zelltypen mit außergewöhnlich hohen Membrankapazitäten würde dies, im Gegensatz zu Gold, noch zu einer zweifelsfreien Detektion von Zellen auf der Elektrodenoberfläche führen. Die gute Biokompatibilität von LSG wurde anhand von Zellfärbungen mit anschließender mikroskopischer Überprüfung genauso bestätigt wie durch die Ergebnisse der Impedanzspektroskopie.
Metadata last modified: 27 Sep 2022 05:52
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