| License: Creative Commons Attribution 4.0 (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-511313
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.51131
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 November 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralph Witzgall |
| Date of exam: | 22 November 2021 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie > Prof. Dr. Ralph Witzgall |
| Keywords: | miRNA; podocyte; filtration barrier |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 51131 |
Abstract (English)
Improvement of sequencing techniques lead to identification of more than 38.500 miRNAs in the last decades. In 2019 the human genome contained 2654 mature miRNAs while the murine genome encodes 2013 mature miRNAs (Kozomara et al., 2019). Constitutive deletion of the two miRNA processing enzymes in mice (Drosha and Dicer) revealed the importance of miRNA not only for development, but also for ...
Abstract (English)
Improvement of sequencing techniques lead to identification of more than 38.500 miRNAs in the last decades. In 2019 the human genome contained 2654 mature miRNAs while the murine genome encodes 2013 mature miRNAs (Kozomara et al., 2019). Constitutive deletion of the two miRNA processing enzymes in mice (Drosha and Dicer) revealed the importance of miRNA not only for development, but also for maintenance of normal podocyte structure and function (Harvey et al., 2008; Ho et al., 2008; Shi et al., 2008; Zhdanova et al., 2011). miRNAs post-transcriptionally regulate specific target mRNAs and are involved in various cellular processes. Podocytes are specialized cells which cover the glomerular tuft and show a complex cytoarchitecture. In-between their foot processes, a delicate membrane called slit diaphragm (SD) is build up by specific proteins. Together with the GBM and the fenestrated endothelium, the podocytes (including the SD) form the renal filtration barrier, where the blood filtration takes place. Loss of Dicer or Drosha and thus disturbed canonical miRNA biogenesis leads to podocyte foot processes effacement and following proteinuria, indicating that proteins of the filtration barrier might be targets of miRNA-mediated regulation. For a better understanding of the role of miRNAs for podocyte structure and filtration function, it is necessary to identify target genes of specific miRNAs.
In the present work, the main focus lied on the identification of podocyte-specific miRNA-mRNA interactions that play an important role for podocyte structure and function. In previous studies potential miRNA regulated target genes were identified by using in silico predictions (Baumgarten et al., unpublished). These putative interactions between miRNAs and their target mRNAs were analyzed using luciferase assay. An interaction between miR-29a-3p and murine and human Sparc was identified. Mutations of the miRNA binding site within the 3’UTR of the target mRNA lead to a derepression of luciferase activity, thus, the observed interaction was verified to be specific. Also an interaction between miR-101-3p and Npnt/NPNT as well as miR-503-5p and VegfA/VEGFA could be confirmed. For the two target mRNAs Arrdc3 and SERINC3, an interaction was observed in only one specie. However, due to non-conserved interaction between murine and human transcript, loss-of-function luciferase assay was not performed for further verification. For Per1, Zfp36 and STT3A no interaction could be identified.
In addition, generated mir-30a-5p and mir-146b-5p knockout cell lines (Baumgarten et al., unpublished) were used to analyze the effect of miRNA loss in podocytes for differentiation. Knockout cells showed differentiation difficulties and stayed smaller than the control cells. Measurement of cell area was used to reinforce the observation. Cells were differentiated for two weeks and staining with HSC Cell Mask Red stain. Using ImageJ analysis cell area was measured showing significant smaller cells in miRNA knockout cells compared to the control cells. Rescue experiment using specific miRNA mimics was performed, however, a possible positive effect of miRNA mimics on cell area, arborization or specific podocyte markers could not be evaluated due to technical problems. To further investigate the effect of miRNAs on podocyte integrity, optimization of the evaluation method must be carried out.
The transcription factor LMX1B plays an important role for the maintenance of podocyte structure and function and is known to regulate miRNA expression. However, Lmx1b is also a potential target of miRNA regulation. To identify the interactions between Lmx1b/LMX1B and the predicted miRNAs, luciferase assays were used. For the murine transcript, a positive interaction with the miR-210-3p could be demonstrated at position 1665-1670 in the 3’UTR sequence. The second binding site at position 3236-3274 seems to be not active. For the human transcript, interactions with miR-135a-5p, miR-615-3p and miR-101a-5p were identified. Verification of miRNA binding sites by loss-of function luciferase assay were not performed due to non-conserved interactions between murine and human transcript however might be performed in the future.
Constitutive deletion of Dicer and Drosha as well as inducible podocyte-specific deletion of Drosha demonstrated the importance of miRNAs for the kidney function (Harvey et al., 2008; Ho et al., 2008; Shi et al., 2008; Zhdanova et al., 2011). However, a knockout of Dicer in fully developed adult kidneys has not been characterized so far. Therefore, a mouse line with inducible deletion of Dicer in podocytes were generated and used to investigate the effect of miRNA loss in adult kidneys. Knockout mice developed proteinuria after three weeks of induction with further progression. Glomeruli of knockout mice displayed matrix proliferation and glomerular tuft collapse as well as vacuolization of epithelial cells after six weeks of induction. Moreover, proteinaceous casts were observed in the mildly diluted renal tubules. Ultrastructural visualization showed beginning abnormalities after three weeks with further progression after six weeks. With beginning onset of proteinuria, some podocyte foot processes were effaced with still normal formed foot processes. After six weeks, all podocyte foot processes showed an effacement. The observed phenotype is comparable to the constitutive Dicer and Drosha mice, reinforcing the importance of miRNA for the maintenance of podocyte structure and kidney function.
To investigate the effect of miRNA on target mRNAs in vivo, freshly isolated podocyte from Dicer knockout and control mice were analyzed using qPCR analysis. The six examined target mRNAs Sparc, Npnt, VegfA, Dusp1, Cd2ap and Fyn were chosen due to identified specific miRNA-mRNA interaction by luciferase assay within this study and in previous studies (Baumgarten et al., unpublished). Dicer knockout was induced for three, seven and 24 days by administration of doxycycline. After FACS analysis, RNA was isolated from podocyte cells and transcribed to cDNA. After three days, no more Dicer expression could be observed in the knockout mice. Five out of the six examined mRNAs, expression levels were increased in knockout mice compared to control mice. For VegfA, Npnt and Dusp1 significant increment was observed. For Sparc and Cd2ap no marked difference could be measured. After seven days, all mRNAs displayed decreased levels in the knockout-mice as well as after 24 days. Since Dicer expression was not detectable after three days postinduction, decreased levels of mRNAs after seven and 24 days might already be due to secondary effect.
Altogether, the present work further contributes to enlighten the miRNA-mediated regulatory network in podocytes, which is crucial for the maintenance of podocyte structure and function in renal filtration.
Translation of the abstract (German)
Die Verbesserung der Sequenzierungstechniken führte in den letzten Jahrzehnten zur Identifizierung von mehr als 38.500 miRNAs. Im Jahr 2019 enthielt das menschliche Genom 2654 reife miRNAs, während das Mausgenom 2013 reife miRNAs kodiert (Kozomara et al., 2019). Die konstitutive Deletion der beiden miRNA-Prozessierungsenzyme bei Mäusen (Drosha und Dicer) zeigte die Bedeutung der miRNA nicht nur ...
Translation of the abstract (German)
Die Verbesserung der Sequenzierungstechniken führte in den letzten Jahrzehnten zur Identifizierung von mehr als 38.500 miRNAs. Im Jahr 2019 enthielt das menschliche Genom 2654 reife miRNAs, während das Mausgenom 2013 reife miRNAs kodiert (Kozomara et al., 2019). Die konstitutive Deletion der beiden miRNA-Prozessierungsenzyme bei Mäusen (Drosha und Dicer) zeigte die Bedeutung der miRNA nicht nur für die Entwicklung, sondern auch für die Aufrechterhaltung der normalen Podozytenstruktur und -funktion (Harvey et al., 2008; Ho et al., 2008; Shi et al., 2008; Zhdanova et al., 2011). miRNAs regulieren auf posttranskriptioneller Ebene spezifische Ziel-mRNAs und sind an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt. Podozyten sind spezialisierte Zellen, die das glomeruläre Kapillarknäuel bedecken und eine komplexe Zytoarchitektur aufweisen. Zwischen ihren Fußfortsätzen wird eine empfindliche Membran (Schlitzdiaphragma) von bestimmten Proteinen aufgebaut. Die Podozyten (einschließlich des Schlitzdiaphragmas) bilden zusammen mit dem GBM und dem fenestrierten Endothel die renale Filtrationsbarriere, an der die Blutfiltration stattfindet. Der Verlust von Dicer oder Drosha und die daraus resultierende gestörte kanonische miRNA-Biogenese führt zum Verlust der Podozytenfußfortsätzen und zur Proteinurie. Dies deutet darauf hin, dass Proteine der Filtrationsbarriere Ziele der miRNA-vermittelten Regulation sein könnten. Um die Rolle von miRNAs für die Podozytenstruktur und die Filtrationsfunktion besser zu verstehen, ist es notwendig, Zielgene spezifischer miRNAs zu identifizieren.
In der vorliegenden Arbeit lag der Schwerpunkt auf der Identifizierung von Podozyten-spezifischen miRNA-mRNA-Interaktionen, die eine wichtige Rolle für die Struktur und Funktion des Podozyten spielen. In früheren Studien wurden potenzielle miRNA-regulierte Zielgene mithilfe von In-silico-Vorhersagen identifiziert (Baumgarten et al., unveröffentlicht). Diese potentiellen Interaktionen zwischen miRNAs und ihren Ziel-mRNAs wurden mittels Luciferase Reporter -Assay analysiert. Es wurde eine Interaktion zwischen der miR-29a-3p und murinem und humanem Sparc identifiziert. Mutationen der miRNA-Bindungsstelle innerhalb der 3’UTR der Ziel-mRNA führen zu einer Derepression der Luciferase-Aktivität, was die beobachtete Interaktion bestätigt. Auch eine Interaktion zwischen miR-101-3p und Npnt/NPNT sowie miR-503-5p und VegfA/VEGFA konnte bestätigt werden. Für die beiden Ziel-mRNAs Arrdc3 und SERINC3 wurde eine Interaktion nur bei einer Spezies beobachtet. Aufgrund der nicht konservierten Interaktion zwischen Maus- und Human-Transkript wurde jedoch kein Loss of function-Luciferase-Assay zur weiteren Verifizierung durchgeführt. Für Per1, Zfp36 und STT3A konnte keine Interaktion identifiziert werden.
Darüber hinaus wurden generierte mir-30a-5p- und mir-146b-5p-Knockout-Zelllinien (Baumgarten et al., unveröffentlicht) verwendet, um den Effekt des miRNA-Verlustes auf die Differenzierung von Podozyten zu analysieren. Knockout-Zellen zeigten Differenzierungsschwierigkeiten und blieben kleiner als die Kontrollzellen. Die Messung der Zellfläche wurde verwendet, um die Beobachtung zu untermauern. Die Zellen wurden zwei Wochen lang differenziert und mit HSC Cell Mask Red gefärbt.
Die Analyse der Zellfläche mittels ImageJ-Analyse zeigte, dass die Zellen in den miRNA-Knockout-Zellen signifikant kleiner waren im Vergleich zu den Kontrollzellen. Bei den Rettungsexperimenten mit spezifischen miRNA-Mimics konnte jedoch ein möglicher positiver Effekt aufgrund von technischer Probleme nicht bewertet werden. Um die Wirkung von miRNAs auf die Podozytenintegrität weiter zu untersuchen, muss die Auswertungsmethode optimiert werden.
Der Transkriptionsfaktor LMX1B spielt eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Podozytenstruktur und -funktion und reguliert die miRNA-Expression. LMX1B ist jedoch auch ein potenzielles Ziel der miRNA-Regulation. Um die Interaktionen zwischen Lmx1b/LMX1B und den vorhergesagten miRNAs zu identifizieren, wurden Luciferase Reporter-Assays verwendet. Für das Maustranskript konnte eine positive Interaktion mit der miR-210-3p an Position 1665-1670 in der 3’UTR-Sequenz nachgewiesen werden. Die zweite Bindungsstelle an Position 3236-3274 scheint nicht aktiv zu sein. Für das humane Transkript wurden Interaktionen mit miR-135a-5p, miR-615-3p und miR-101a-5p identifiziert. Die Verifizierung der miRNA-Bindungsstellen durch Loss of function-Luciferase-Assays wurde aufgrund nicht konservierter Interaktionen zwischen Maus- und Human-Transkript nicht durchgeführt. Dies könnte jedoch in Zukunft noch durchgeführt werden.
Die konstitutive Deletion von Dicer und Drosha sowie die induzierbare podozytenspezifische Deletion von Drosha zeigten die Bedeutung von miRNAs für die Nierenfunktion (Harvey et al., 2008; Ho et al., 2008; Shi et al., 2008; Zhdanova et al ., 2011). Ein Knockout von Dicer bei voll entwickelten erwachsenen Nieren wurde jedoch bisher noch nicht beschrieben. Daher wurde eine Mauslinie mit induzierbarer Deletion von Dicer in Podozyten erzeugt und verwendet, um die Wirkung des miRNA-Verlusts in erwachsenen Nieren zu untersuchen. Knockout-Mäuse entwickelten nach dreiwöchiger Induktion eine Proteinurie, welche weiter fortschritt. Glomeruli von Knockout-Mäusen zeigten nach sechswöchiger Induktion eine Matrixproliferation und einen glomerulären Kapillarknäuelkollaps sowie eine Vakuolisierung von Epithelzellen. Darüber hinaus wurden in den leicht erweiterten Nierentubuli proteinhaltige Ablagerungen beobachtet. Die ultrastrukturelle Visualisierung zeigte nach drei Wochen beginnende Anomalien mit einer weiteren Progression nach sechs Wochen. Mit Beginn der Proteinurie zeigten sich neben normal geformten Fußfortsätzen auch Bereich mit fehlenden Fußfortsätze. Nach sechs Wochen zeigten sich keine intakten Podozyten-Fußfortsätze mehr. Der beobachtete Phänotyp ist vergleichbar mit den konstitutiven Dicer- und Drosha-Mäusen, was die Bedeutung der miRNA für die Aufrechterhaltung der Podozytenstruktur und Nierenfunktion unterstreicht.
Um die Wirkung von miRNAs auf Ziel-mRNAs in vivo zu untersuchen, wurden frisch isolierte Podozyten aus Dicer-Knockout- und Kontrollmäusen mittels qPCR-Analyse analysiert. Die sechs untersuchten Ziel-mRNAs Sparc, Npnt, VegfA, Dusp1, Cd2ap und Fyn wurden aufgrund der identifizierten spezifischen miRNA-mRNA-Interaktion durch den Luciferase-Assay in dieser Studie und in früheren Studien (Baumgarten et al., unveröffentlicht) ausgewählt. Der Dicer-Knockout wurde für drei, sieben und 24 Tage durch die Gabe von Doxycyclin induziert. Nach der FACS-Analyse wurde RNA aus Podozytenzellen isoliert und in cDNA transkribiert. Nach drei Tagen konnte bei den Knockout-Mäusen keine Dicer-Expression mehr beobachtet werden. Fünf der sechs untersuchten mRNAs-Expressionsspiegel waren bei den Knockout-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen erhöht. Für VegfA, Npnt und Dusp1 wurde ein signifikanter Anstieg beobachtet. Für Sparc und Cd2ap konnte kein deutlicher Unterschied gemessen werden. Nach sieben Tagen als auch nach 24 Tagen zeigten alle mRNAs bei den Knockout-Mäusen erniedrigte Spiegel. Da die Dicer-Expression drei Tage nach der Induktion nicht nachweisbar war, könnten die erniedrigte mRNA-Spiegel nach sieben und 24 Tagen bereits auf einen Sekundäreffekt zurückzuführen sein.
Insgesamt trägt die vorliegende Arbeit weiter dazu bei, das miRNA-vermittelte regulatorische Netzwerk in Podozyten aufzuklären, welches für die Aufrechterhaltung der Podozytenstruktur und -funktion entscheidend ist.
Metadata last modified: 22 Nov 2022 05:56
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