![[img]](https://epub.uni-regensburg.de/style/images/fileicons/application_pdf.png) | License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 (22MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-532935
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.53293
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 9 December 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Dina Grohmann |
| Date of exam: | 1 December 2022 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Dina Grohmann |
| Keywords: | Cas12a, CRISPR/Cas, FRET |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 53293 |
Abstract (English)
The CRISPR-Cas system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated proteins) is a widespread and versatile prokaryotic immune system, that evolved to sequence-dependently recognize and cleave foreign nucleic acids. The single-effector nuclease of the type V-A CRISPR-Cas system, Cas12a, binds and cleaves double-stranded target DNA with the aid of a CRISPR-RNA ...
Abstract (English)
The CRISPR-Cas system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated proteins) is a widespread and versatile prokaryotic immune system, that evolved to sequence-dependently recognize and cleave foreign nucleic acids. The single-effector nuclease of the type V-A CRISPR-Cas system, Cas12a, binds and cleaves double-stranded target DNA with the aid of a CRISPR-RNA (crRNA). Similar to Cas9, Cas12a was increasingly used in genome editing applications during the past years. Cas12a comprises a bilobal structure with the REC and the Nuc lobe connected by the bridge helix (BH) and helix 1 of the REC2 domain. These helices perform a tandem movement upon the transition from the binary to the ternary complex.
In this thesis, Cas12a from Francisella novicida (Fn) was analyzed utilizing several biochemical and smFRET (single-molecule Förster Resonance Energy Transfer) assays to elucidate its conformational flexibility and transitions when binding to crRNA and target DNA. The smFRET measurements revealed the hitherto unknown open conformational state of the apo form of Cas12a that is in equilibrium with a closed state of the protein. The binding of the crRNA leads to a shift to the closed conformation. Binding of target DNA requires the re-opening of Cas12a, which consequently adopts a semi-closed conformation in the ternary complex.
In a mutational analysis, the roles of the BH and helix 1 on the enzymatic activity and conformational flexibility of FnCas12a were investigated. Thereby, the importance of the BH for the trimming activity of Cas12a at the non-target strand of the DNA as well as its influence on the mismatch sensitivity was revealed. This resulted in two variants with improved mismatch recognition and cleavage accuracy in in vitro assays. smFRET measurements showed that BH variants preferentially adopt the open conformation in the apo state and that the transition to the closed conformation is inefficient for the binary complex. The semi-closed conformation of the ternary complex, however, is readily adopted even if the BH is deleted in its entirety. In summary, it was shown that the BH impacts the catalytic activity and conformational transitions of FnCas12a.
Analyses on helix 1 variants revealed that this is the predominant structural element linking the REC and the Nuc lobe conferring stability to the whole protein. Deletion of helix 1 leads to a conformational collapse of FnCas12a and the closure of the protein is no longer possible. Disturbance of the concerted tandem movement of BH and helix 1 drastically decreases the cleavage activity of FnCas12a but does not affect the conformational transitions. The structural remodeling of the helices upon DNA binding is linked to the closed-to-open movement of the ‘lid’, a loop that closes the active site in the binary complex and opens if DNA is bound. Therefore, the tandem movement of BH and helix 1 is involved in the allosteric activation of the active site.
Translation of the abstract (English)
Das CRISPR-Cas-System (clustered regularly interspaced short palindromic repeats und CRISPR associated proteins) ist ein vielseitiges und weit verbreitetes prokaryotisches Abwehrsystem, das fremde Nukleinsäuren sequenzabhängig erkennt und spaltet. Die eigenständige Effektornuklease des CRISPR-Cas-Systems V-A, Cas12a, bindet und spaltet doppelsträngige Ziel-DNA mit Hilfe einer CRISPR-RNA (crRNA). ...
Translation of the abstract (English)
Das CRISPR-Cas-System (clustered regularly interspaced short palindromic repeats und CRISPR associated proteins) ist ein vielseitiges und weit verbreitetes prokaryotisches Abwehrsystem, das fremde Nukleinsäuren sequenzabhängig erkennt und spaltet. Die eigenständige Effektornuklease des CRISPR-Cas-Systems V-A, Cas12a, bindet und spaltet doppelsträngige Ziel-DNA mit Hilfe einer CRISPR-RNA (crRNA). Ähnlich wie Cas9 wurde auch Cas12a in den letzten Jahren zunehmend in Genom-Editierungsanwendungen eingesetzt. Cas12a weist eine zweiflüglige Struktur auf, wobei der REC- und der Nuc-Flügel durch die Bridge Helix (BH) und Helix 1 der REC2-Domäne verbunden sind. Diese Helices führen beim Übergang vom binären zum ternären Komplex eine Tandembewegung aus.
In dieser Arbeit wurde Cas12a von Francisella novicida (Fn) mit Hilfe verschiedenster biochemischer und biophysikalischer Experimente charakterisiert. Dies schloss Einzelmolekül-FRET (Förster Resonanz Energie Transfer) Messungen ein. Die FRET-Messungen deckten den bisher unbekannten offenen Zustand von Cas12a in seiner Apo-Form auf, der im Equilibrium mit einer geschlossenen Konformation des Proteins steht. Die Bindung der crRNA führt zu einem Übergang in die geschlossene Konformation. Bindung einer Ziel-DNA zusätzlich zur crRNA führt zu einer Öffnung von Cas12a, welches dadurch eine halbgeschlossene Konformation einnimmt.
In einer Mutationsanalyse wurden BH und Helix 1 auf ihre Rolle in der enzymatischen Aktivität und Konformationsflexibilität von FnCas12a untersucht. Die BH beeinflusst die Trimmaktivität von Cas12a am Nicht-Zielstrang der DNA und hat Auswirkungen auf die Mismatch-Empfindlichkeit des Enzyms. Durch die Mutationsstudie wurden zwei Cas12a Varianten mit verbesserter Mismatch-Erkennung und Spaltgenauigkeit identifiziert. Einzelmolekül-FRET Messungen zeigten, dass die BH-Varianten im Apo-Zustand die offene Konformation bevorzugen und dass hier der Übergang in die geschlossene Konformation des binären Komplexes ineffizient ist. Die halbgeschlossene Konformation kann jedoch selbst bei vollständiger Deletion der BH angenommen werden. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die BH die katalytische Aktivität und die konformationellen Zustände von Cas12a beeinflusst.
Analysen von Helix 1-Varianten zeigten, dass diese Helix das strukturelle Element ist, das den REC- und den Nuc-Flügel verbindet und dem gesamten Protein Stabilität verleiht. Die Deletion von Helix 1 führt zu einem Zusammenbruch der konformationellen Flexibilität von FnCas12a und das Schließen des Proteins ist nicht mehr möglich. Eine Störung der konzertierten Tandembewegung von BH und Helix 1 verringert die Spaltungsaktivität von FnCas12a drastisch, ohne jedoch die einzelnen Konformationszustände zu beeinflussen. Es deutet darauf hin, dass die strukturellen Neuordnungen der Helices bei DNA-Bindung mit der geschlossen/offen-Bewegung des ‚Deckels‘ verbunden sind, einer Schleife, die das aktive Zentrum im binären Komplex verschließt und dieses öffnet, sobald DNA gebunden wird. Die Tandembewegung von BH und Helix 1 ist daher an der allosterischen Aktivierung des aktiven Zentrums beteiligt.
Metadata last modified: 09 Dec 2022 09:32
Owner only: item control page
Download Statistics