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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-545927
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.54592
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 21 August 2023 |
| Referee: | PD Dr. Patrick Babinger |
| Date of exam: | 24 April 2023 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | REM-hypothesis, RNA-binding, metabolic enzymes, Escherichia coli, SELEX, iCLIP, moonlighting function |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 54592 |
Abstract (English)
Massive research efforts are being expended to comprehend all aspects of the complex interactome within living organisms. Much of the complexity of cellular regulation stems from the incredible broad spectrum of interactions between RNAs and proteins, two macromolecular species intertwined since the origin of life. While many RNA-binding protein domains have been characterized and classified, we ...
Abstract (English)
Massive research efforts are being expended to comprehend all aspects of the complex interactome within living organisms. Much of the complexity of cellular regulation stems from the incredible broad spectrum of interactions between RNAs and proteins, two macromolecular species intertwined since the origin of life. While many RNA-binding protein domains have been characterized and classified, we might yet know relatively little about certain unconventional modes of RNA binding, like binding mediated by disordered protein regions. One particular field that is poorly researched relative to its potential extent is the hypothesized crosstalk between RNAs, metabolic enzymes, and metabolites, a generalized concept known as REM hypothesis.
It is substantiated by only few isolated case examples like the dual-functional enzyme aconitase. Technological advancement has given rise to experiments producing extensive interactome data, and metabolic enzymes are frequently being found within RNA interactomes. This provoked request for more directive research investigating the scope of metabolic enzyme-RNA interactions.
Because prokaryotes feature particularly poor insights into the matter, this work aimed to rationally select bacterial enzyme candidates and examine their ability to bind RNAs. In this line, roughly twenty Escherichia coli enzymes were chosen from different metabolic pathways based on recent interactome data and literature references of any kind that hinted towards a physiologically relevant enzyme-RNA interaction. Experimental efforts were mainly focused on
systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX), utilizing a confined sequence pool containing only RNAs that are transcripts of the Escherichia coli genome and thus potential biologically relevant targets. In addition, high-throughput sequencing of RNA fragments isolated by crosslinking immunoprecipitation (CLIP-Seq) was conducted for a subset of the enzymes, comprising a complementary method that captures and identifies RNAs in close proximity to the enzyme in vivo.
While the majority of enzyme candidates displayed no specific discrimination of RNAs when exposed to the genomic library, seven of them caused enrichment of specific RNA-sequences or -features: Pyruvate kinase enriched a particular set of RNAs, albeit with no apparent common feature. Phosphoglycerate kinase enriched A-rich loop sequences within hairpins. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase enriched highly variable AU-rich sequence stretches. Aconitase enriched variable hairpins with a 3’-adjacent U-rich sequence. Thymidylate synthase enriched hairpins with a strictly conserved AGA-triloop. Glutamate-5-kinase enriched a small number of particular RNAs. Finally, quinone oxidoreductase enriched particular RNAs which share a moderately stringent sequence motif. The enrichments among these seven enzymes were of varying significance and interpretability. Not all of the potential interactions showed substantial specificity or were observable at all in subsequent electrophoretic mobility shift assay (EMSA) analysis, suggesting that genomic SELEX produced a ‘best of the worst’ selection in such instances. For pyruvate kinase and phosphoglycerate kinase, which constituted such cases, complementary CLIP-Seq data was obtained and revealed no specific RNA binding, challenging physiological relevance of these enzyme’s genomic SELEX results in conjunction with unremarkable EMSAs.
Out of the seven enzymes with notable genomic SELEX results, two were validated to have specific RNA-binding properties: Glutamate-5-kinase and quinone oxidoreductase both displayed unambiguous discriminatory RNA-binding in competition EMSAs probing enriched RNA fragments. A more detailed RNA-binding characterization was pursued for quinone oxidoreductase, which strongly enriched a transcript fragment of yffO. The respective RNA-enzyme complex could be disrupted by NADPH, indicating a participation of the Rossmann fold domain of quinone oxidoreductase in binding. The KD of quinone oxidoreductase binding to the yffO mRNA fragment was estimated to be moderate in vitro (7 μM), measured by both EMSA titration and microscale thermophoresis. This moderate KD indicates that the interaction possibly relies on unidentified in vivo conditions if it was to be biologically significant. YffO is a grounded prophage gene, and it is unknown but conceivable that it has evolved towards a novel function which is beneficial for Escherichia coli.
Overall, specific RNA enrichment was absent or unverifiable for the majority of candidates. Nevertheless, the established RNA-binding specificities of glutamate-5-kinase and quinone oxidoreductase uphold the possibility that RNA-related moonlighting functions can be occassionally found among bacterial metabolic enzymes and certainly prompt further investigation on their biological relevance.
Translation of the abstract (German)
Großer Forschungsaufwand fließt in das Unterfangen, alle Aspekte des komplexen Interaktoms von lebenden Organismen zu verstehen. Die Komplexität der zellulären Regulation ist maßgeblich geprägt von einem sehr breiten Spektrum an Interaktionen zwischen Proteinen und RNAs - zwei molekulare Spezies, die seit dem Ursprung des Lebens vernetzt sind. Obwohl schon viele RNA-Bindedomänen charakterisiert ...
Translation of the abstract (German)
Großer Forschungsaufwand fließt in das Unterfangen, alle Aspekte des komplexen Interaktoms von lebenden Organismen zu verstehen. Die Komplexität der zellulären Regulation ist maßgeblich geprägt von einem sehr breiten Spektrum an Interaktionen zwischen Proteinen und RNAs - zwei molekulare Spezies, die seit dem Ursprung des Lebens vernetzt sind. Obwohl schon viele RNA-Bindedomänen charakterisiert und klassifiziert wurden, werden bestimmte RNA-Bindungsmodi, wie zum Beispiel Bindung durch intrinsisch ungeordnete Proteinregionen, potenziell nur oberflächlich verstanden. Eine kaum untersuchtes Feld mit womöglich großer Tragweite ist die potenzielle Vernetzung von RNAs, metabolischen Enzymen und Metaboliten, ein Konzept benannt als REM Hypothese. Das Konzept ist nur durch wenige bekannte Beispiele veranschaulicht, wie das bifunktionelle Enzym Aconitase. Technologischer Fortschritt hat es Experimenten ermöglicht große Mengen an RNA Interaktom Daten zu produzieren, und metabolische Enzyme treten dabei regelmäßig als Treffer auf. Hierdurch entstand eine Notwendigkeit für zielgerichtete Forschung, welche die Interaktionen zwischen metabolischen Enzymen und RNAs genauer charakterisiert.
Weil das Feld gerade bei Prokaryoten schlecht untersucht ist, zielte diese Arbeit darauf, gezielt bakterielle Enzym-Kandidaten auszuwählen und auf ihre RNA-Bindung hin zu untersuchen. Zu diesem Zwecke wurden anhand von aktuellen Interaktom-Daten und Literatur-Referenzen ca. zwanzig Escherichia Coli Enzyme aus verschiedensten metabolischen Stoffwechselwegen ausgewählt. Die Experimente fokussierten sich hauptsächlich auf SELEX (Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung), wobei ein Sequenzpool verwendet wurde, der nur aus Escherichia coli Transkripten besteht und somit nur potenzielle biologisch relevante Targets enthält. Desweiteren wurde als komplementäre Methode für einen Teil der Kandidaten iCLIP (Crosslinking & Immunopräzipitation) mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung der isolierten RNA-Fragmente, welche sich in vivo in unmittelbarer Nähe der Kandidaten-Enzyme befinden, durchgeführt.
Während die Mehrheit der Enzymkandidaten im SELEX keine spezifische Anreicherung im genomischen RNA Pool bewirkten, war dies für sieben Kandidaten doch der Fall: Pyruvatkinase reicherte bestimmte RNA-Sequenzen an, bei denen sich jedoch kein gemeinsames Struktur oder Sequenzmotif identifizieren lies. Phosphoglycerat-Kinase reicherte Haarnadel-Sequenzen mit A-reichen Loops an. Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase reicherte sehr variable AU-reiche Sequenzbereiche an. Aconitase reicherte verschiedene Haarnadelstrukturen an, die alle in angrenzender 3'-Richtung eine U-reiche Sequenz aufweisen. Thymidylatsynthase reicherte Haarnadelstrukturen mit strikt konserviertem AGA-Triloop an. Glutamat-5-kinase reicherte eine kleine Zahl an bestimmten RNA-Sequenzen an. Quinonoxidoreduktase reicherte bestimmte RNAs mit einem moderat stringent definiertem Sequenzmotif an. Die bei diesen sieben Enzymen beobachteten RNA Anreicherungen waren von variabler Signifikanz und Interpretierbarkeit. Nicht alle dieser potenziellen Interaktionen zeigten substanzielle Spezifität, oder waren in anschließenden elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungs-Assays (EMSAs) nachvollziehbar, was bedeuten könnte dass genomisches SELEX in manchen Fällen eine 'Beste der Schlechten' Selektion produziert haben könnte. Für Pyruvatkinase und Phosphoglyceratkinase, die solche Fälle darstellen, konnten komplementäre CLIP-Sequenzierungsdatensätze aufgenommen werden und zeugten von keiner spezifischen Bindung, was in Verbindung mit EMSA Ergebnissen unter Umständen die physiologische Relevanz der SELEX Ergebnisse für diese Enzyme in Frage stellt.
Von den sieben Enzymen mit auffälligen SELEX Resultaten konnten für zwei Enzyme spezifische RNA-Bindeeigenschaften in Validierungsexperimenten gezeigt werden: Glutamate-5-kinase und Quinonoxidoreduktase zeigten beide eindeutig diskriminatorisches RNA-Bindeverhalten in Kompetitions-EMSAs mit den angereicherten RNA-Fragmenten. Eine detailliertere Charakterisierung der RNA-Bindung wurde für Quinonoxidoreduktase durchgeführt, welche ein bestimmtes Transkriptfragment des yffO Gens stark angereichert hatte. Die Ausbildung des entsprechenden RNA-Enzym Komplexes konnte mittels NADPH gestört werden, was bedeuten könnte dass die Rossmann-Faltungsdomäne von Quinonoxidorekutase an der Bindung beteiligt ist. Der KD der Bindung von Quinonoxidoreduktase zu dem yffO mRNA-Fragment wurde auf einen Wert von 7 µM abgeschätzt, anhand von sowohl EMSA-Titrationsdaten als auch Microscale-Thermophoresedaten. Dieser moderate KD-Wert könnte bedeuten, dass, falls eine biologische Relevanz vorläge, die Interaktion auf noch nicht identifizierten in vivo Bedingungen beruht. YffO ist ein geeredetes Prophagen-System, und es ist unbekannt ob (aber denkbar dass) das Gen sich hin zu einer neuen Funktion entwickelt hat, die vorteilhaft für die Escherichia coli Zelle ist.
Zusammengefasst konnte spezifische RNA-Anreicherung für die Mehrheit der Kandidaten nicht nachgewiesen werden. Nichtsdestotrotz halten die etablierten, spezifischen RNA-Bindeverhalten von Glutamate-5-kinase und Quinonoxidoreduktase die Möglichkeit offen, dass RNA-involvierende Moonlighting-Funktionen sporadisch unter den bakteriellen metabolischen Enzymen vorkommen, und verlangen nach weiteren Untersuchungen in Bezug auf ihre biologische Relevanz.
Metadata last modified: 21 Aug 2023 12:09
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