In the baker’s yeast ‘Saccharomyces cerevisiae’, production of all ribosomal RNAs, except one, relies on transcription by RNA-Polymerase I (Pol I). Transcription of the rDNA gene follows the formation of the Pol I pre-initiation complex (Pol I PIC). Over the last decades, numerous studies have provided insight into structure and function of Pol I, as well as its transcription
factors Rrn3, ...
Zusammenfassung (Deutsch)
In the baker’s yeast ‘Saccharomyces cerevisiae’, production of all ribosomal RNAs, except one, relies on transcription by RNA-Polymerase I (Pol I). Transcription of the rDNA gene follows the formation of the Pol I pre-initiation complex (Pol I PIC). Over the last decades, numerous studies have provided insight into structure and function of Pol I, as well as its transcription
factors Rrn3, TATA-binding protein (TBP), and Core Factor (CF). The fourth transcription factor – the upstream activating factor ‘UAF’ – has been shown to function as a potent enhancer of Pol I transcription initiation, repressor of RNA-Pol-II transcription, and as a maintainer of a native rDNA copy levels. However, to the day this project was started, structural information about this factor was completely missing. With this project, we aimed at providing additional functional insight and structural information about this important complex in order to contribute to a more comprehensive understanding of transcription
initiation by Pol I.
During this project, expression and purification protocols for UAF subunits and the whole complex were optimized, followed by functional characterization and crystallization attempts. Functional characterization of subunits Uaf30 and the Rrn9 / Rrn10 subcomplex showed, that both – Uaf30 and Rrn9 – play an important role for the interaction with the upstream element. We show that promoterbinding by Rrn9 is likely unspecific and that it relies on a C terminal DNA binding domain. Uaf30, in contrast, shows a significant preference
towards an upstream region of the upstream element around position -100 relative to the transcription start site. From this data, we hypothesize, that promoter targeting by UAF may rely on tethering by Uaf30, while Rrn9 cooperatively binds the promoter further downstream in an unspecific manner to strengthen the interaction between UAF and DNA.
To challenge these claims, Rrn9-C and Uaf30 deletion mutants were additionally tested in context of the whole UAF complex. In line with the previous results, deletion of Uaf30 leads to a notable loss of specificity, while deletion of Rrn9-C only exhibits reduced overall affinity.
A double deletion mutant combines both loss of affinity and specificity. The impact of both deletions on the stimulation of transcription initiation by Pol I was tested via in vitro transcription assays. Interestingly, deletion of Uaf30 almost completely abolishes the transcription enhancement by UAF when compared to the wildtype complex and ΔC Rrn9 mutant. Contrary to expectations, in the latter, while transcription of the wildtype DNA
template is less enhanced compared to the wildtype complex, transcription of the control template without an upstream element was significantly enhanced.
With the aim of providing structural data, a variety of constructs were subjected to high throughput crystallization screenings. Although isolation of crystallization grade protein was achieved for many of these constructs, including homologs from the baker’s yeasts thermophilic relative - Chaetomium thermophilum, the bottleneck of actual protein
crystallization turned out to be a major limiting factor. Only very few crystals were obtained and measured at a synchrotron. Neither did these crystals diffract, nor could they be reproduced.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In der Bäckerhefe „Saccharomyces cerevisiae“ werden mit Ausnahme einer, alle ribosomalen RNAs, durch RNA-Polymerase I (Pol I) produziert. Die Transkription des rDNA-Gens folgt der Bildung des Pol I-Präinitiationskomplexes (Pol I PIC). In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Studien Einblicke in die Struktur und Funktion von Pol I sowie die der zugehörigen Transkriptionsfaktoren Rrn3, ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In der Bäckerhefe „Saccharomyces cerevisiae“ werden mit Ausnahme einer, alle ribosomalen RNAs, durch RNA-Polymerase I (Pol I) produziert. Die Transkription des rDNA-Gens folgt der Bildung des Pol I-Präinitiationskomplexes (Pol I PIC). In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Studien Einblicke in die Struktur und Funktion von Pol I sowie die der zugehörigen Transkriptionsfaktoren Rrn3, TATA-Binding Protein (TBP) und Core Factor (CF) geliefert. Die vierte Transkription Faktor – Upstream Activating Factor „UAF“ – fungiert sowohl als Verstärker der Pol I-Transkriptionsinitiation, Repressor der RNA-Pol-II-Transkription und als Regulator der Größe des rDNA locus. Doch bis zum Start dieses Projektes, gab es keinerlei strukturelle Information zu diesem Faktor. Mit diesem Projekt haben wir uns zum Ziel gesetzt, weitere funktionelle Einblicke und strukturelle Informationen zu erschließen, um zu einem umfassenderen Verständnis der Transkriptionsinitiation durch Pol I beizutragen.
Die funktionelle Charakterisierung der Untereinheiten Uaf30 und des Rrn9 / Rrn10 – Subkomplexes zeigte, dass sowohl Uaf30 als auch Rrn9 eine wichtige Rolle für die Interaktion mit dem Upstream Element spielen. Wir zeigen, dass die Promotorbindung durch Rrn9 wahrscheinlich unspezifisch ist und für die Binding auf eine C-terminale DNA – Bindungsdomäne zurückgreift. Uaf30 hingegen zeigt eine deutliche Spezifität in einem Bereich um Position -100 Basenpaare upstream der Transkriptionsstartseite. Aufgrund dieser Daten gehen wir davon aus, dass das Promoter - Targeting durch UAF auf sequenzspezifischer Promotererkennung durch Uaf30 beruht, während Rrn9 den Promotor weiter stromabwärts unspezifisch bindet, um die Interaktion zwischen UAF und DNA zu stärken. Um diese Hypothese zu testen, wurden zusätzlich Rrn9 - C und Uaf30 - Deletionsmutanten getestet. Im Einklang mit den vorherigen Ergebnissen führt die Deletion von Uaf30 dazu zu einem deutlichen Spezifitätsverlust, während die Deletion von Rrn9-C nur eine verringerte Gesamtaffinität aufweist. Eine Doppeldeletionsmutante kombiniert sowohl den Verlust der Affinität als auch der Spezifität.
Mit dem Ziel, Strukturdaten zu generieren, wurden verschiedene Konstrukte im High Throughput Kristallisationsscreening getestet. Obwohl die Isolierung von Protein in Kristallisationsqualität für viele dieser Konstrukte möglich war, konnten keine nennenswerten Ergebnisse erzielt werden. Als größtes Hindernis erwies sich dabei die Kristallisation der Proteine.
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