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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-585942
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.58594
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 11 June 2025 |
| Referee: | PD Dr. Steffen Pockes |
| Date of exam: | 11 June 2024 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry I (Prof. Elz) |
| Keywords: | GPCR, Monomers, Heteromers, Bioluminescence, Radioactivity-based Techniques |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 58594 |
Abstract (English)
In the last decades various test systems were established to characterize pharmacological tools like radioligands and fluorescent ligands, as well as, evaluating binding affinities and selectivity of novel ligands. Furthermore, they are capable to investigate receptor monomers and heteromers and their functional properties. In this thesis three different bioluminescent test systems comprising ...
Abstract (English)
In the last decades various test systems were established to characterize pharmacological tools like radioligands and fluorescent ligands, as well as, evaluating binding affinities and selectivity of novel ligands. Furthermore, they are capable to investigate receptor monomers and heteromers and their functional properties.
In this thesis three different bioluminescent test systems comprising the spilt NanoLuc-based miniG recruitment method, the further downstream CAMYEN BRET-based biosensor and a G-case sensor derived from the TRUPATH system were applied to the five (human) dopamine receptors. Therefore, in case of the miniG recruitment assay the small bit of the split NanoLuc was fused to the C-terminus of the respective (human) dopamine receptor, while the large bit was introduced N-terminally to the canonical miniG protein. For the CAMYEN BRET assay the whole NanoLuc was cloned to the C-terminus of an Epac cAMP binding domain, and mCitrine to the N-terminus. In case of the G-case sensor the whole NanoLuc is cloned into the Gα subunit of a G protein trimer, and the cpVenus protein is fused to the N-terminus of the corresponding Gγ subunit. With the combination of these different techniques the five (human) dopamine receptors were characterized with respect to ligand induced efficacy, different G protein recruitment with involving bias signaling and comparison of close-receptor-signaling or further downstream signal trafficking. Those techniques enable to investigate a pharmacological profile of the dopamine receptor family and the characterization of G protein coupling, ligand efficacies and potencies, as well as the differentiation between agonist, antagonists and inverse agonists.
Moreover, a radioligand as a useful tool for radioligand binding experiments for the H3R was characterized by overcoming drawbacks, of agonistic ligands such as receptor internalization in cell-based systems or selectivity issues within the histamine receptor family. The chosen pharmacophore was a propionylated JNJ-5207852 scaffold, which was tritium labeled. In radioligand saturation binding experiments the radioligand revealed curves in a saturable manner with a binding affinity in the sub nanomolar range and obtained a high H3R selectivity compared to the other members of the histamine receptor family. In kinetic studies the fast association and complete dissociation was verified. Furthermore, in competition binding experiments in the presence of the radioligand [3H]UR-MN259 several H3R standard agonists and antagonist were tested and the resulted pKi values were comparable with literature data. Therefore, a selective and high affinity radioligand for the H3R was developed and characterized as a novel tool for the investigation of new ligands in robust radioligand binding studies.
The investigation of the pharmacological properties of heterodimers of the class A family is necessary due to their involvement in e.g., neurodegenerative diseases like Parkinson’s disease or Alzheimer’s disease. Furthermore, to address these drug targets novel bivalent ligands were synthesized in-house and needed to be evaluated in their binding affinities, efficacies and confirmed as true bivalent ligands. Therefore, a radioligand binding assay was developed for the reported D1R-H3R and D2lR-H3R heteromers.
For the D1R-H3R the suggested stoichiometric receptor ratio in vitro of 1:2, leading to functional heterodimers, was obtained and biphasic curves for the bivalent ligand NR330 were achieved. The resulting pKi,high value was not higher as at the monomer receptor. Further experiments with the bivalent ligand NR330 in the presence of an additional competitor were performed, in order to test whether the biphasic curve can be transformed to a monophasic curve by blocking one protomer of the D1-H3R heteromer. For the H3R mode the D1R antagonist SCH-23390 (c = 10 µM) and in the D1R mode the antagonistic H3R ligand JNJ-5207852 (c =10 µM) were used. The resulting monophasic curve of NR330 in the presence of either the D1R or H3R competitor was right shifted compared to the curve on the mono-expressed receptor and showed an additional decrease in the specific binding of both radioligands (D1R protomer: [3H]SCH-23390, H3R protomer: [3H]UR-MN259). We hypothesized a cross binding affinity of the D1R competitor to the H3R protomer and vice versa. Thus, the respective ligands were investigated on the respective D1R and H3R mono-expressing cell lines. The bivalent ligand NR330 resulted a monophasic curve in all three chosen buffers (sodium-free or sodium-containing) at the D1R monomer, as expected, but different binding affinities which were negatively affected in the presence of sodium. At the H3R monomer the expected monovalent curve was observed in sodium-free BB and BB supplemented with 100 mM NaCl. In contrast, in both buffers containing 140 mM NaCl (Leibovitz’s L15 media and BB with 140 mM NaCl) no statistically correct binding mode was validated and both modes (monophasic and biphasic curves) were specified. With respect to the amount of the specific binding of the radioligand [3H]SCH-23390 the observed plateau of NR330 at the H3R was different compared to the resulted one of NR330 on D1R-H3R co-expressing HEK239T cells. Therefore, we assume a true bivalent binding mode of NR330 on D1R-H3R co-expressing HEK239T cells with a stoichiometric receptor ratio of 1:2.
The antagonistic H3R ligands JNJ-5207852 and MN259 showed no binding affinity to the D1R monomer, although a negative cooperativity was observed in combination with the D1R standard antagonist SCH-23390. In case of the H3R monomer the affinity of the D1R antagonist SCH-23390 was dependent on the used buffers. In sodium containing buffer supplemented 140 mM NaCl, the binding affinity was in micromolar range, while in BB supplemented with 100 mM NaCl, the affinity was increased to the nanomolar range. In contrast, in BB without supplements a biphasic curve for SCH-23390 was observed. The observed two binding modes in sodium-free buffer were thus changed to a monovalent binding mode in sodium containing buffer, which implies a sodium-dependent effect. Furthermore, the combination of the H3R ligands JNJ-5207852 or MN259 with 10 µM SCH-23390 led to right-shifted curves and a drop in signal of the specific binding of the radioligand [3H]UR-MN259 in all buffers. Therefore, we hypothesized a possible allosteric modulation of SCH-23390 to the H3R ligands. Unfortunately, we could not confirm this hypothesis completely and further investigations are necessary.
For the D2lR-H3R heteromer a radioligand binding assay was likewise developed. The observed curves of the bivalent ligands MN079 and MN240 were primarily monophasic in different receptor ratios (1:1, 1:2.4 and 1:3.7), while MN240 achieved a biphasic curve only in the D2lR-mode on co-expressing cells with a stoichiometric receptor ratio of 1:1.8. The assumed receptor ratio for the formation of functional heteromers of the class A GPCRs is 1:2 in vitro, which could not be achieved during this PhD.
However, to characterize the efficacies of bivalent ligands a functional miniG protein recruitment assay was applied to the D2lR-H3R heteromer. The small bit of the split Nano luciferase was fused to the C-terminus of the H3R, whereas the large bit was cloned between the D2lR and the miniGsi protein, tethered through flexible linkers. The recruitment of the miniGsi could be observed in real-time after the activation by histamine and gave hints to the existence of the formation of the D2lR-H3R heteromer, compared to the observed traces on the H3R monomer. All analyzed H3R standard ligands gave robust concentration-response-curves, while in contrast no activation for the D2-like agonist dopamine and pramipexole was achieved. Moreover, we were able to observe a possible cross-interaction between the D2lR-H3R heteromer. The affinity of histamine in the presence of 100 µM dopamine was right-shifted to nanomolar range and a drop in the signal was observed compared to histamine without additional competitor. A further possible explanation is the asymmetric recruitment of the miniGsi protein by one protomer, due to an excess limitation. Thus, further experiments are necessary to confirm the negative cooperativity by introducing a point mutation in the G protein binding pocket of the D2lR7 and changing of the linker length to the miniG protein to evaluate a possible impact, as well as, the fusion of the small bit to the D2lR and the NLucN-miniGsi construct to the H3R.
In summary, it was not possible to develop a radioligand binding assay for both heteromers to characterize the respective novel bivalent ligands with sufficient replicates. However, the results are promising to confirm the ligands as true bivalent ligands, but further investigations are necessary. Thus, for competition binding experiments with an additional competitor the competitors should be changed to (+)-butaclamol in the H3R mode and to GSK33449 in case of the D1R mode to obtain monophasic curves of the bivalent ligand and to obtain monophasic curves without a decreased signal-to-noise ratio on co-expressing cells. Additionally, the end-capped ligands as further controls, should be included. For all following studies on the D1R-H3R heteromer, the buffer needs to be changed to a sodium-containing buffer, like Leibovitz’s L-15 media, to alleviate the sodium impact on the binding affinities and properties. Therefore, all previously obtained experiments with the bivalent ligand with or without an additional competitor need to be performed in this buffer. For the D2lR-H3R heteromer the correct stoichiometric receptor ratio in vitro needs to be evaluated, followed by competition binding experiments in the presence of suitable competitors in both modes, for the complete characterization of the novel bivalent ligands.
The last project of this thesis was the development of a NanoBRET-based assay for the five (human) dopamine receptors to investigate the binding affinities of novel ligands with a reliable and robust test system like in radioligand binding experiments. The NanoLuc as BRET donor was N-terminally fused to the respective (human) dopamine receptor where a fluorescent ligand can bind and the non-radioactive energy transfer takes place, referred as BRET. The investigated fluorescent ligands of either the D1-like or D2-like dopamine receptors consist of a selective pharmacophore (D1-like: SCH-23390 analogue, D2-like: spiperone analogue) connected through alkyl or PEG linker with the TAMRA or DY-549P1 dye.
For the D1-like family the most promising fluorescent ligand NR435 consists of the SCH-23390 pharmacophore, a short linker and the TAMRA fluorophore and yielded an affinity in the nanomolar range. For the D2-like family the fluorescent ligand MN212 with a spiperone analogue, the shortest linker and the TAMRA dye was characterized for the D2lR and obtained likewise the highest affinity. Due to the high homology between the D2-like receptors MN212 was tested at the D3R with an eight-fold lower affinity compared to the D2lR. For both, competition binding experiments with different literature described D2-like standard ligands were performed, with comparable pKi values to published data. In this study, we could observe a negative modulation of the binding affinity by introducing the DY-549P1 dye to the fluorescent ligands. In previous work the respective linker length, properties like hydrophilic or lipophilic entities and the fluorophore are considered to affect the binding properties of the linker.
Due to a change of the device (from Tecan Infinite® Lumi plate reader to CLARIOStarPlus plate reader) all observed results were not reproducible at the CLARIOStarPlus under the same conditions. We suggest, due to a device specific signal-to-noise ratio, that the emission of the fluorescent ligand was not detectable anymore with the CLAIOStarPlus, although we were able to detect the blue light emission of the NanoLuc (λ = 480 nM). It is known that there is no direct correlation between the receptor expression and the observed BRET signal. The optimal amount of NanoLuc-tagged receptor can be verified by transiently performed experiments. Due to the limitation in time kinetic studies, outstanding saturation or competition binding experiments for all dopamine receptor and the respective fluorescent ligands could not be performed.
Translation of the abstract (German)
In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Testsysteme zur Charakterisierung pharmakologischer Hilfsmittel wie Radioliganden und fluoreszierende Liganden sowie zur Bewertung der Bindungsaffinität und Selektivität neuartiger Liganden entwickelt. Darüber hinaus sind sie in der Lage, Rezeptormonomere und -heteromere und deren funktionelle Eigenschaften zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden ...
Translation of the abstract (German)
In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Testsysteme zur Charakterisierung pharmakologischer Hilfsmittel wie Radioliganden und fluoreszierende Liganden sowie zur Bewertung der Bindungsaffinität und Selektivität neuartiger Liganden entwickelt. Darüber hinaus sind sie in der Lage, Rezeptormonomere und -heteromere und deren funktionelle Eigenschaften zu untersuchen.
In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Biolumineszenz-Testsysteme, bestehend aus der NanoLuc-basierten miniG-Rekrutierungsmethode, dem nachgeschalteten CAMYEN BRET-basierten Biosensor und einem aus dem TRUPATH-System abgeleiteten G-Case-Sensor, auf die fünf (menschlichen) Dopaminrezeptoren angewendet. Im Falle des miniG-Rekrutierungstests wurde daher das kleine Bit des gespaltenen NanoLuc an den C-Terminus des jeweiligen (menschlichen) Dopaminrezeptors fusioniert, während das große Bit N-terminal an das kanonische miniG-Protein eingeführt wurde. Für den CAMYEN BRET Assay wurde das gesamte NanoLuc an den C-Terminus einer Epac cAMP-Bindungsdomäne und mCitrine an den N-Terminus kloniert. Im Falle des G-Case-Sensors wurde das gesamte NanoLuc an die Gα-Untereinheit eines G-Protein-Trimers kloniert, und das cpVenus-Protein wurde an den N-Terminus der entsprechenden Gγ-Untereinheit fusioniert. Mit der Kombination dieser verschiedenen Techniken wurden die fünf (humanen) Dopaminrezeptoren hinsichtlich ihrer ligandeninduzierten Wirksamkeit, der unterschiedlichen G-Protein-Rekrutierung mit einbeziehender Bias-Signalisierung und dem Vergleich der rezeptornahen Signalübertragung oder des weiteren nachgeschalteten Signalverkehrs charakterisiert. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung eines pharmakologischen Profils der Dopaminrezeptorfamilie und die Charakterisierung der G-Protein-Kopplung, der Ligandenwirksamkeiten und -potenzen sowie die Unterscheidung zwischen Agonisten, Antagonisten und inversen Agonisten.
Darüber hinaus wurde ein Radioligand als nützliches Werkzeug für Radioliganden-Bindungsexperimente für den H3R charakterisiert, indem Nachteile agonistischer Liganden, wie die Internalisierung des Rezeptors in zellbasierten Systemen oder Selektivitätsprobleme innerhalb der Histaminrezeptorfamilie, überwunden wurden. Das gewählte Pharmakophor war ein propionyliertes JNJ-5207852-Gerüst, das mit Tritium markiert war. In Radioliganden-Sättigungsbindungsexperimenten zeigte der Radioligand sättigbare Kurven mit einer Bindungsaffinität im subnanomolaren Bereich und erreichte eine hohe H3R-Selektivität im Vergleich zu den anderen Mitgliedern der Histaminrezeptorfamilie. In kinetischen Studien wurde die schnelle Assoziation und vollständige Dissoziation nachgewiesen. Darüber hinaus wurden in Konkurrenzbindungsexperimenten in Gegenwart des Radioliganden [3H]UR-MN259 verschiedene H3R-Standardagonisten und -Antagonisten getestet, und die ermittelten pKi-Werte waren mit Literaturdaten vergleichbar. Daher wurde ein selektiver Radioligand mit hoher Affinität für H3R entwickelt und als neues Instrument für die Untersuchung neuer Liganden in robusten Radioliganden-Bindungsstudien charakterisiert.
Die Untersuchung der pharmakologischen Eigenschaften von Heterodimeren der Klasse-A-Familie ist notwendig, da sie z. B. bei neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinsonschen oder der Alzheimerschen Krankheit eine Rolle spielen. Darüber hinaus wurden neue bivalente Liganden intern synthetisiert, die auf ihre Bindungsaffinität und Wirksamkeit hin untersucht und als echte bivalente Liganden bestätigt werden mussten, um diese Arzneimittelziele zu erreichen. Daher wurde ein Radioliganden-Bindungstest für die gemeldeten D1R-H3R- und D2lR-H3R-Heteromere entwickelt.
Für den D1R-H3R wurde das vorgeschlagene stöchiometrische Rezeptorverhältnis von 1:2 in vitro erreicht, was zu funktionalen Heterodimeren führt, und es wurden biphasische Kurven für den bivalenten Liganden NR330 erzielt. Der resultierende pKi,high-Wert war nicht höher als beim monomeren Rezeptor. Weitere Experimente mit dem bivalenten Liganden NR330 in Gegenwart eines zusätzlichen Konkurrenten wurden durchgeführt, um zu prüfen, ob die biphasische Kurve durch Blockieren eines Protomers des D1-H3R-Heteromers in eine monophasische Kurve umgewandelt werden kann. Für den H3R-Modus wurde der D1R-Antagonist SCH-23390 (c = 10 µM) und für den D1R-Modus der antagonistische H3R-Ligand JNJ-5207852 (c = 10 µM) verwendet. Die resultierende monophasische Kurve von NR330 in Anwesenheit des D1R- oder H3R-Konkurrenten war im Vergleich zur Kurve am monoexprimierten Rezeptor rechtsverschoben und zeigte eine zusätzliche Abnahme der spezifischen Bindung beider Radioliganden (D1R-Protomer: [3H]SCH-23390, H3R-Protomer: [3H]UR-MN259). Wir vermuteten eine Kreuzbindungsaffinität zwischen dem D1R-Konkurrenten und dem H3R-Protomer und vice versa. Daher wurden die entsprechenden Liganden an den jeweiligen D1R- und H3R-monoexprimierenden Zelllinien untersucht. Der bivalente Ligand NR330 ergab in allen drei gewählten Puffern (natriumfrei oder natriumhaltig) am D1R-Monomer erwartungsgemäß eine monophasische Kurve, aber unterschiedliche Bindungsaffinitäten, die in Gegenwart von Natrium negativ beeinflusst wurden. Beim H3R-Monomer wurde die erwartete monovalente Kurve in natriumfreiem BB und in mit 100 mM NaCl angereichertem BB beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde in den beiden Puffern mit 140 mM NaCl (Leibovitz's L15-Medien und BB mit 140 mM NaCl) kein statistisch korrekter Bindungsmodus validiert und beide Modi (monophasische und biphasische Kurven) wurden angegeben. In Bezug auf die Höhe der spezifischen Bindung des Radioliganden [3H]SCH-23390 war das beobachtete Plateau von NR330 am H3R anders als das von NR330 an D1R-H3R koexprimierenden HEK239T-Zellen. Daher gehen wir von einem echten bivalenten Bindungsmodus von NR330 an D1R-H3R-koexprimierenden HEK239T-Zellen mit einem stöchiometrischen Rezeptorverhältnis von 1:2 aus. Die antagonistischen H3R-Liganden JNJ-5207852 und MN259 zeigten keine Bindungsaffinität zum D1R-Monomer, obwohl eine negative Kooperativität in Kombination mit dem D1R-Standardantagonisten SCH-23390 beobachtet wurde. Im Falle des H3R-Monomers war die Affinität des D1R-Antagonisten SCH-23390 abhängig von den verwendeten Puffern. In natriumhaltigem Puffer mit 140 mM NaCl lag die Bindungsaffinität im mikromolaren Bereich, während in BB mit 100 mM NaCl die Affinität bis in den nanomolaren Bereich erhöht war. Im Gegensatz dazu wurde in BB ohne Zusätze eine biphasische Kurve für SCH-23390 beobachtet. Die in natriumfreiem Puffer beobachteten zwei Bindungsmodi wandelten sich also in natriumhaltigem Puffer zu einem monovalenten Bindungsmodus, was auf einen natriumabhängigen Effekt schließen lässt. Darüber hinaus führte die Kombination der H3R-Liganden JNJ-5207852 oder MN259 mit 10 µM SCH-23390 zu rechtsverschobenen Kurven und einem Signalabfall der spezifischen Bindung des Radioliganden [3H]UR-MN259 in allen Puffern. Daher vermuteten wir eine mögliche allosterische Modulation von SCH-23390 an den H3R-Liganden. Leider konnten wir diese Hypothese nicht vollständig bestätigen und weitere Untersuchungen sind erforderlich.
Für das D2lR-H3R-Heteromer wurde ebenfalls ein Radioligandenbindungsassay entwickelt. Die beobachteten Kurven der bivalenten Liganden MN079 und MN240 waren bei unterschiedlichen Rezeptorverhältnissen (1:1, 1:2,4 und 1:3,7) überwiegend monophasisch, während MN240 nur im D2lR-Modus auf koexprimierenden Zellen mit einem stöchiometrischen Rezeptorverhältnis von 1:1,8 eine biphasische Kurve erreichte. Das angenommene Rezeptorverhältnis für die Bildung funktioneller Heteromere der Klasse-A-GPCRs beträgt in vitro 1:2, was bei dieser Promotion nicht erreicht werden konnte.
Um jedoch die Wirksamkeit bivalenter Liganden zu charakterisieren, wurde ein funktioneller miniG-Protein-Rekrutierungstest auf das D2lR-H3R-Heteromer angewendet. Der kleine Teil der gespaltenen Nano-Luciferase wurde an den C-Terminus des H3R fusioniert, während der große Teil zwischen das D2lR und das miniGsi-Protein geklont wurde, verbunden durch flexible Linker. Die Rekrutierung des miniGsi konnte in Echtzeit nach der Aktivierung durch Histamin beobachtet werden und gab Hinweise auf die Bildung des D2lR-H3R-Heteromers, verglichen mit den beobachteten Spuren am H3R-Monomer. Alle untersuchten H3R-Standardliganden ergaben robuste Konzentrations-Wirkungs-Kurven, während im Gegensatz dazu keine Aktivierung für den D2-like Agonisten Dopamin und Pramipexol erreicht wurde. Außerdem konnten wir eine mögliche Kreuzinteraktion zwischen dem D2lR-H3R-Heteromer beobachten. Die Affinität von Histamin in Gegenwart von 100 µM Dopamin war in den nanomolaren Bereich rechtsverschoben, und es wurde ein Abfall des Signals im Vergleich zu Histamin ohne zusätzlichen Konkurrenten beobachtet. Eine weitere mögliche Erklärung ist die asymmetrische Rekrutierung des miniGsi-Proteins durch ein Protomer aufgrund einer Überschussbegrenzung. Daher sind weitere Experimente erforderlich, um die negative Kooperativität zu bestätigen, indem eine Punktmutation in die G-Protein-Bindungstasche des D2lR7 eingeführt und die Linkerlänge zum miniG-Protein geändert wird, um eine mögliche Auswirkung zu bewerten, ebenso wie die Fusion des kleinen Bits mit dem D2lR und des NLucN-miniGsi-Konstrukts mit dem H3R.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es nicht möglich war, einen Radioliganden-Bindungstest für beide Heteromere zu entwickeln, um die jeweiligen neuen bivalenten Liganden mit ausreichenden Wiederholungen zu charakterisieren. Die Ergebnisse sind jedoch vielversprechend, um die Liganden als echte bivalente Liganden zu bestätigen, doch sind weitere Untersuchungen erforderlich. So sollten bei Konkurrenzbindungsexperimenten mit einem zusätzlichen Konkurrenten die Konkurrenten zu (+)-Butaclamol im H3R-Modus und zu GSK33449 im Falle des D1R-Modus geändert werden, um monophasische Kurven des bivalenten Liganden zu erhalten und um monophasische Kurven ohne ein verringertes Signal-Rausch-Verhältnis auf koexprimierenden Zellen zu erhalten. Zusätzlich sollten die endverkappten Liganden als weitere Kontrollen einbezogen werden. Für alle folgenden Studien zum D1R-H3R-Heteromer muss der Puffer durch einen natriumhaltigen Puffer, wie Leibovitz' L-15-Medium, ersetzt werden, um den Einfluss von Natrium auf die Bindungsaffinitäten und -eigenschaften zu verringern. Daher müssen alle zuvor durchgeführten Experimente mit dem bivalenten Liganden mit oder ohne einen zusätzlichen Kompetitor in diesem Puffer durchgeführt werden. Für das D2lR-H3R-Heteromer muss das korrekte stöchiometrische Rezeptorverhältnis in vitro evaluiert werden, gefolgt von Konkurrenzbindungsexperimenten in Anwesenheit geeigneter Konkurrenten in beiden Modi, um die neuen bivalenten Liganden vollständig zu charakterisieren.
Das letzte Projekt dieser Arbeit war die Entwicklung eines NanoBRET-basierten Assays für die fünf (menschlichen) Dopaminrezeptoren, um die Bindungsaffinitäten neuartiger Liganden mit einem zuverlässigen und robusten Testsystem wie in Radioliganden-Bindungsexperimenten zu untersuchen. Der NanoLuc als BRET-Donor wurde N-terminal an den jeweiligen (menschlichen) Dopaminrezeptor fusioniert, wo ein fluoreszierender Ligand binden kann und der nicht-radioaktive Energietransfer stattfindet, der als BRET bezeichnet wird. Die untersuchten fluoreszierenden Liganden der D1-ähnlichen oder D2-ähnlichen Dopaminrezeptoren bestehen aus einem selektiven Pharmakophor (D1-ähnlich: SCH-23390-Analogon, D2-ähnlich: Spiperon-Analogon), das über einen Alkyl- oder PEG-Linker mit dem Farbstoff TAMRA oder DY-549P1 verbunden ist.
Für die D1-ähnliche Familie besteht der vielversprechendste fluoreszierende Ligand NR435 aus dem SCH-23390-Pharmakophor, einem kurzen Linker und dem TAMRA-Fluorophor und weist eine Affinität im nanomolaren Bereich auf. Für die D2-like-Familie wurde der fluoreszierende Ligand MN212 mit einem Spiperon-Analogon, dem kürzesten Linker und dem TAMRA-Farbstoff für den D2lR charakterisiert und erzielte ebenfalls die höchste Affinität. Aufgrund der hohen Homologie zwischen den D2-like Rezeptoren wurde MN212 am D3R mit einer achtfach geringeren Affinität im Vergleich zum D2lR getestet. Für beide wurden Konkurrenzbindungsexperimente mit verschiedenen in der Literatur beschriebenen D2-like Standardliganden durchgeführt, wobei die pKi-Werte mit den veröffentlichten Daten vergleichbar waren.
In dieser Studie konnten wir eine negative Modulation der Bindungsaffinität durch die Einführung des Farbstoffs DY-549P1 in die fluoreszierenden Liganden beobachten. In früheren Arbeiten wurde davon ausgegangen, dass die jeweilige Linkerlänge, Eigenschaften wie hydrophile oder lipophile Einheiten und das Fluorophor die Bindungseigenschaften des Linkers beeinflussen.
Aufgrund eines Gerätewechsels (vom Tecan Infinite® Lumi Plattenlesegerät zum CLARIOStarPlus Plattenlesegerät) waren alle beobachteten Ergebnisse am CLARIOStarPlus unter den gleichen Bedingungen nicht reproduzierbar. Wir vermuten, dass aufgrund eines gerätespezifischen Signal-Rausch-Verhältnisses die Emission des fluoreszierenden Liganden mit dem CLAIOStarPlus nicht mehr nachweisbar war, obwohl wir die Blaulicht-Emission des NanoLuc (λ = 480 nM) nachweisen konnten. Es ist bekannt, dass es keine direkte Korrelation zwischen der Rezeptorexpression und dem beobachteten BRET-Signal gibt. Die optimale Menge an NanoLuc-markiertem Rezeptor kann durch transient durchgeführte Experimente überprüft werden. Aufgrund der Beschränkung der zeitkinetischen Studien konnten keine herausragenden Sättigungs- oder Konkurrenzbindungsexperimente für alle Dopaminrezeptoren und die jeweiligen fluoreszierenden Liganden durchgeführt werden.
Metadata last modified: 11 Jun 2025 04:16
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