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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-586752
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.58675
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 7 Januar 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Christine Ziegler |
| Tag der Prüfung: | 16 Juli 2024 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Christine Ziegler |
| Stichwörter / Keywords: | membrane protein; cryo-EM; drug target; structural biology; TPC2; SGLT; SPA cryo-EM; ion channel |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 58675 |
Zusammenfassung (Englisch)
Single Particle Analysis (SPA) cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) has become a powerful tool in the field of structural biology. Membrane proteins, in particular, have greatly benefited from the numerous advantages of SPA cryo-EM, including the ability to determine structures of multiple conformational states. The near-atomic resolution structures of membrane proteins, which are major drug ...
Zusammenfassung (Englisch)
Single Particle Analysis (SPA) cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) has become a powerful tool in the field of structural biology. Membrane proteins, in particular, have greatly benefited from the numerous advantages of SPA cryo-EM, including the ability to determine structures of multiple conformational states. The near-atomic resolution structures of membrane proteins, which are major drug targets, provide valuable insights for structure-guided drug design by allowing direct visualization of drug-protein interactions. This can lead to the development of more effective and safer drugs. However, the structural analysis of membrane proteins using SPA cryo-EM is a challenging task. In this study, we focused on two emerging drug targets using SPA cryo-EM. The investigation included members of the Solute Carrier 5 (SLC5) family, specifically sodium-glucose cotransporters (SGLTs) that are linked to Type II diabetes mellitus and cardiovascular diseases. Additionally, we studied Two-Pore Channel 2 (TPC2), an endolysosomal ion-selective channel implicated in cancer proliferation and viral infection.
The production of proteins in adequate quality and quantity, along with their purification, is a crucial prerequisite for SPA cryo-EM. However, these tasks can be particularly challenging for mammalian membrane proteins. These proteins exhibit poor responses to changes in the membrane environment, lack of appropriate interaction partners, and alterations in post-translational modifications during heterologous expression. The primary objective of this study was to establish optimal conditions to produce SLC5 transporters and TPC2 for biochemical and structural investigations. Various membrane-mimicking systems, including amphipols and nanodiscs, were evaluated to determine their suitability for the study of mammalian membrane proteins using a model protein, the Green-light absorbing proteorhodopsin (GPR).
While structural studies of SLC5 transporters were not possible within this thesis, the valuable experience gained in working on SLC5 transporters was instrumental to successfully solve structures of the TPC2 channel in complex with agonist and inhibitors. This was possible mainly due to the extensive screening of expression conditions for SLC5 transporters, which led to the use of lentiviral stable cell lines successfully applied to SGLT3 and TPC2, respectively. Also, experience gained due to the extensive screening of purification procedures for the SGLT homologues helped in the TPC2 project. Membrane protein purification per se is far from trivial due to their hydrophobic and fragile nature requesting either constant presence of detergent or reconstitution in a membrane mimic. In this thesis, both, detergent reconstitution as well as reconstitution into nanodiscs or amphipols was successfully applied. This was possible due to initial screening of protocols using the pentameric bacterial channel GPR, for which a SPA cryo-EM map at a resolution of 3.64 Å could be determined. Most importantly, GPR reconstitution allowed to screen parameters such as lipid-to-protein ratios, incubation times, salt concentration etc. These optimized protocols helped reconstitute the mammalian targets, for which the protein yields were too low to perform such a screening. The selection of Saposin-based nanodiscs for SGLT3 and glyco-diosgenin (GDN) for TPC2 proved to be the most effective reconstitution systems for structural studies. Notably, several high-resolution SPA cryo-EM structures for TPC2 were obtained under varying conditions, leading to the visualization and comprehension of specific agonist-antagonist interactions.
A structure of TPC2 in complex with the inhibitor naringenin revealed the pivotal role of lipids and detergent on the open state of the TPC2 channel. By a systematic comparison with a published PI(3,5)P2-activated open state, it was possible to describe the key interactions of the pore blocker naringenin with one of the gating residues. A structure in complex with NAADP-mimicking agonist TPC2-A-N1 pointed towards an alternative opening mechanism distinct from the PI(3,5)P2-activation. Two structures of TPC2 in complex with the agonist SGA-111 provided multiple important insights into NAADP-like activation. Firstly, the structures shed light into the tautomer-specificity of agonist binding, which is an important step towards the development of new drugs. Secondly, SGA-111 binding triggered changes to the complex two-layered selectivity filter, which is key to the enigmatic ion selectivity switch from Na+ to Ca2+ upon NAADP-activation. While in PI(3,5)P2-activation the conformation of the selectivity filter is not altered, SGA-111 binding reveals a remodulation which most likely account for the selectivity switch. Moreover, the structural work in this thesis highlights the impact of specific lipid interactions aside of the well-known PI(3,5)P2-interaction. Three lipids were identified as regulators for the concerted movements of the linker helices connecting the voltage-sensor domains to the pore domain. These findings show for the first time the interference of a lipophilic agonist with regulatory lipids and will initiate new strategies to develop lipophilic agonists for TPC2.
Understanding the structural interactions of lipophilic small-molecule agonists and inhibitors with TPC2 provides insights into its physiological and pathophysiological roles, but also open new strategies in drug development. In recent years, TPC2 has emerged as a promising novel drug target for various diseases, e.g. infectious diseases such as Ebola virus, SARS-CoV-2, or cholera. Inhibiting TPC2 has demonstrated efficacy in reducing cancer cell migration, and neoangiogenesis. The understanding of the different molecular activation mechanisms of TPC2 will provide important new impulses for drug development.
In summary, the results of this thesis have opened new research projects on the SLC5 transporter SGLT3 and on the GPR channel, respectively, and provided new molecular insights into the differences in activation mechanisms of TPC2.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die kryo-elektronenmikroskopische (kryo-EM) Einzelteilchenanalyse hat sich in den letzten Jahren zu einer leistungsstarken Methode auf dem Gebiet der Strukturbiologie entwickelt. Insbesondere die strukturelle Analyse von Membranproteinen hat enorm von den zahlreichen Entwicklungen profitiert. Atomare Strukturen von Membranproteinen, die wichtigsten biologischen Ziele für Arzneimittel, können ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die kryo-elektronenmikroskopische (kryo-EM) Einzelteilchenanalyse hat sich in den letzten Jahren zu einer leistungsstarken Methode auf dem Gebiet der Strukturbiologie entwickelt. Insbesondere die strukturelle Analyse von Membranproteinen hat enorm von den zahlreichen Entwicklungen profitiert. Atomare Strukturen von Membranproteinen, die wichtigsten biologischen Ziele für Arzneimittel, können wertvolle Erkenntnisse für Ligand-Protein-Wechselwirkungen liefern. Dies kann ein wichtiger Beitrag zur Herstellung wirksamer und sicherer Medikamente sein. Die Strukturanalyse von Membranproteinen mittels kryo-EM Einzelteilchenanalyse stellt jedoch eine anspruchsvolle Aufgabe dar. In dieser Arbeit liegt der Fokus auf der strukturellen Untersuchung zweier neuer möglicher Wirkstoffziele. Zum einen Mitglieder der Familie der „Solute Carrier 5“ (SLC5), dabei insbesondere Natrium-Glukose-Cotransporter (SGLTs), die mit Diabetes mellitus Typ II und Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Zusammenhang stehen, sowie „Two-Pore Channel 2“ (TPC2), ein endolysosomaler, ionenselektiver Kanal, der an der Proliferation von Krebszellen als auch bei Virusinfektionen beteiligt ist. Die Herstellung von Proteinen in ausreichender Qualität und Menge sowie deren Reinigung sind eine entscheidende Voraussetzung für die kryo-EM Einzelteilchenanalyse. Allerdings stellt diese Aufgabe für Membranproteine von Säugetieren eine besondere Herausforderung dar. Der Wandel in der Membranumgebung, das Fehlen geeigneter Interaktionspartner und die Veränderungen der posttranslationalen Modifikationen während der heterologen Expression, sind hierbei problematisch. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, optimale Bedingungen für die Produktion von SLC5-Transportern und TPC2 zur biochemischen und strukturellen Untersuchung zu entwickeln. Dabei wurden verschiedene membran-nachahmende Systeme, darunter „amphipol“ und „nanodiscs“, getestet, um die Eignung für die Untersuchung von Säugetier-Membranproteinen zu bestimmen. Hierfür wurde ein bakterielles Modellprotein, das grün-absorbierende Proteorhodopsin (GPR) genutzt. Eine strukturelle Analyse von SLC5-Transportern im Rahmen dieser Arbeit war nicht möglich. Jedoch konnten die wertvollen Erkenntnisse, die bei der Arbeit an SLC5-Transportern gewonnen wurden, entscheidend für die erfolgreiche Aufklärung von TPC2-Strukturen mit Agonisten und Inhibitoren genutzt werden. Dies war vor allem durch den umfangreichen Test von Expressionsbedingungen für SLC5-Transporter möglich, welche zur erfolgreichen Nutzung lentiviraler stabiler Zelllinien für SGLT3 bzw. TPC2 führte. Auch die Erfahrungen, die durch die Untersuchung verschiedener Reinigungsverfahren für die SGLTs gewonnen wurden, waren für das TPC2-Projekt hilfreich. Die Reinigung von Membranproteinen an sich ist herausfordernd, da sie durch ihre hydrophoben Bereiche entweder die ständige Anwesenheit von Detergens oder die Rekonstitution in einer Membranumgebung benötigen. In dieser Arbeit wurde sowohl Detergens als auch die Rekonstitution in „nanodiscs“ und „amphipol“ erfolgreich genutzt. Möglich wurde dies durch einen Test der Methoden unter Verwendung des pentameren, bakteriellen Protonenkanals GPR, für welchen eine kryo-EM Struktur mit einer Auflösung von 3,64 Å erzeugt werden konnte. Dabei ermöglichte die GPR-Rekonstitution die Untersuchung von Parametern wie unter anderem Lipid-zu-Protein-Verhältnis, Inkubationszeit und Salzkonzentration. Die optimierten Protokolle wurden dann für die Rekonstitution der Säugetier-Membranproteine genutzt, da für diese die Proteinausbeuten zu niedrig waren, um ein solches Screening durchzuführen. Die Auswahl von Saposin-basierten „nanodiscs“ für SGLT3 und dem Detergens Glyco-Diosgenin (GDN) für TPC2 erwiesen sich als die effektivsten Rekonstitutionssysteme. Für TPC2 konnten somit unter verschiedenen Bedingungen hochaufgelöste kryo-EM Strukturen erzeugt werden, welche zur Darstellung und zum Verständnis spezifischer Agonisten/Antagonisten-Wechselwirkungen führten. Eine Struktur von TPC2 im Komplex mit dem Inhibitor Naringenin zeigt die entscheidende Rolle von Lipiden und Detergens im offenen Zustand des TPC2-Kanals. Durch einen systematischen Vergleich mit dem PI(3,5)P2-aktivierten offenen Zustand war es möglich, die Interaktion des Porenblockers Naringenin mit einer spezifischen Aminosäure im „gate“ von TPC2 zu beschreiben. Eine Struktur mit dem Agonisten TPC2-A-N1, welcher die NAADP-abhängige Aktivierung von TPC2 imitiert, deutet auf einen alternativen Öffnungsmechanismus hin, der sich von der PI(3,5)P2-Aktivierung unterscheidet. Zwei Strukturen von TPC2 mit dem Agonisten SGA-111 lieferten mehrere wichtige Erkenntnisse zur dieser NAADP-imitierenden Aktivierung. Erstens geben die Strukturen Aufschluss über die tautomere Spezifität der Bindung des Agonisten, was einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Entwicklung neuer Medikamente darstellt. Zweitens löste die SGA-111-Bindung Veränderungen am komplexen zweistufigen Selektivitätsfilter aus, welcher der Schlüssel zum Wechsel der Ionenselektivität von Na+ zu Ca2+ bei der NAADP-Aktivierung ist. Während bei der PI(3,5)P2-Aktivierung die Konformation des Selektivitätsfilters nicht verändert wird, zeigt die SGA-111-Bindung eine Änderung, welche höchstwahrscheinlich für den Selektivitätswechsel verantwortlich ist. Darüber hinaus beschreiben die TPC2-Strukturen dieser Arbeit den Einfluss spezifischer Lipid-Wechselwirkungen neben der bekannten PI(3,5)P2-Wechselwirkung. Drei Lipide wurden als Regulatoren für die konzertierten Bewegungen der „Linker Helices“ identifiziert, die die „voltage-sensor“ Domänen mit der Porendomäne verbinden. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal die Wechselwirkung eines lipophilen Agonisten mit regulatorischen Lipiden und können die Grundlage für die Weiterentwicklung dieser Agonisten sein. Das Verständnis der strukturellen Wechselwirkungen von Agonisten und Inhibitoren mit TPC2 liefert Einblicke in seine physiologischen und pathophysiologischen Rollen und eröffnet neue Strategien in der Arzneimittelentwicklung. In den letzten Jahren hat sich TPC2 zu einem vielversprechenden neuen Wirkstoffziel für verschiedene Krankheiten entwickelt, zum Beispiel Infektionskrankheiten wie Ebola, SARS-CoV-2 oder Cholera. Die Inhibierung von TPC2 hat sich als wirksam bei der Reduzierung der Krebszellmigration und der Neoangiogenese erwiesen. Das Verständnis der unterschiedlichen molekularen Aktivierungsmechanismen von TPC2 kann wichtige neue Impulse für die Wirkstoffherstellung liefern.
Die Ergebnisse dieser Arbeit haben grundlegende Erkenntnisse für neue Forschungsprojekte zum SLC5-Transporter SGLT3 bzw. zum GPR-Kanal erzielt und neue molekulare Einblicke in die unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen von TPC2 geliefert.
Metadaten zuletzt geändert: 07 Jan 2025 05:35
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