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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-774906
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.77490
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 5 August 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Antje J. Bäumner |
| Tag der Prüfung: | 29 Juli 2025 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, ehemals Prof. Wolfbeis) |
| Stichwörter / Keywords: | Liposomes, high-throughput-screening, point-of-care, SARS-CoV-2, neutralization tests |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 77490 |
Zusammenfassung (Englisch)
In this thesis, liposomes were used for the development of diagnostic tests due to their unique structural and functional properties. The incorporation of functionalized lipids enables simple modification of liposomes with proteins or other molecules using various established coupling chemistries, making them highly versatile. This is further supported by the potential to encapsulate different ...
Zusammenfassung (Englisch)
In this thesis, liposomes were used for the development of diagnostic tests due to their unique structural and functional properties. The incorporation of functionalized lipids enables simple modification of liposomes with proteins or other molecules using various established coupling chemistries, making them highly versatile. This is further supported by the potential to encapsulate different signaling molecules, including dyes, fluorophores, redox markers and enzymes, facilitating the use of various detection methods and thus fine-tuning of sensitivity, specificity and overall test performance. This allows for innovative sensing strategies that can be integrated into various existing diagnostic frameworks. Here, the fluorescent dye sulforhodamine B (SRB) was used as encapsulant, facilitating both fluorescence and colorimetric detection.
The first experimental part of this work focuses on the development of a surrogate virus neutralization test for SARS-CoV-2 that can be used for both high-throughput screening (HTS) and point-of-care testing (POCT). This goal was achieved by simple modification of SRB liposomes with the receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 using EDC/sulfo-NHS chemistry. The microplate-based HTS assay was able to quantitatively detect neutralizing anti-RBD antibodies and the obtained IC50 values correlated excellently to those from an established pseudovirus neutralization test (pVNT) (r = 0.847). The POC format also showed good correlation to the pVNT (r = 0.614) and allowed for the rapid qualitative detection of neutralizing antibodies. Furthermore, excellent correlation between the HTS and POC format was observed (r = 0.868), highlighting the benefit of using a single signaling conjugate for two independent assays with different detection methods. While original storage stability studies revealed aggregation and loss of angiotensin-converting enzyme 2 receptor (ACE2) binding ability within the first weeks, further optimization improved both the colloidal and protein stability of RBD-modified liposomes, facilitating their use for up to 24 weeks.
The second part focuses on different conjugation strategies for proteins to liposomes. Modification of liposomes with RBD of different SARS-CoV-2 variants using EDC/sulfo-NHS chemistry resulted in unfavorable orientation in the case of Omicron variants due to mutations, preventing interaction with ACE2. Alternatively, the conjugation of different variants of the stabilized trimeric spike protein was investigated, but proved challenging, causing aggregation or inducing leakage of SRB during modification. Various biotinylation strategies were investigated for RBD to enable the use of streptavidin-conjugated liposomes instead, allowing for separate storage of assay components, as well as easy exchange of the conjugated protein. Random biotinylation of amino groups of both the N-terminus and lysine residues using NHS-biotin was shown to be feasible. Better results were achieved by site-directed biotinylation of a Cys-tag using maleimide-biotin conjugates, allowing for the introduction of spacers, such as polyethylene glycol. Site-directed enzymatic biotinylation of an Avi-tag provided the best results and could be applied to all five investigated RBD variants, excelling with its high consistency. Fine-tuning led to the development of a highly sensitive HTS neutralization test for each variant, cut-off values were determined using five seronegative samples before screening of 10 seropositive samples. This showcased the immune escape of Omicron variants, which showed overall lower IC50 values compared to Alpha and Delta. The obtained IC50 values correlated excellently to the pVNT (r = 0.86). The use of neutravidin instead of streptavidin avoids non-specific interaction with proteins containing the RGD sequence, making the format a versatile platform technology that can easily be adapted to other proteins.
The last part explores strategies to improve the sensitivity and user-friendliness of the POC neutralization test. RBD coverage, serum concentration, and LFA strip width were found to be key factors for the assay performance. Furthermore, strategies for on-strip incubation were investigated, including a polyvinyl alcohol barrier and a wax barrier with gap, aiming to enhance the overall ease of use of POC diagnostic tests. Lastly, the capture of neutralized RBD-liposomes was attempted, using a second test line consisting of anti-human Ig antibodies or Protein A, to provide a ‘signal-on’ approach. Non-specific interaction of HSA with antibodies and the abundance of other antibodies not directed against RBD were identified as major obstacles, preventing the implementation of this approach.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
In dieser Arbeit wurden Liposomen aufgrund ihrer einzigartigen strukturellen und funktionellen Eigenschaften für die Entwicklung von diagnostischen Tests verwendet. Der Einbau funktionalisierter Lipide ermöglicht die einfache Modifizierung von Liposomen mit Proteinen oder anderen Molekülen unter Verwendung verschiedener etablierter Kopplungschemien, was sie äußerst vielseitig macht. Hinzu kommt ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
In dieser Arbeit wurden Liposomen aufgrund ihrer einzigartigen strukturellen und funktionellen Eigenschaften für die Entwicklung von diagnostischen Tests verwendet. Der Einbau funktionalisierter Lipide ermöglicht die einfache Modifizierung von Liposomen mit Proteinen oder anderen Molekülen unter Verwendung verschiedener etablierter Kopplungschemien, was sie äußerst vielseitig macht. Hinzu kommt die Möglichkeit, verschiedene Signalmoleküle wie Farbstoffe, Fluorophore, Redoxmarker und Enzyme einzukapseln, was den Einsatz verschiedener Nachweismethoden und damit die Feinjustierung von Sensitivität, Spezifität und Gesamttestleistung erleichtert. Dies ermöglicht innovative Detektionsstrategien, die in verschiedene bestehende Diagnosesysteme integriert werden können. Hier wurde der Fluoreszenzfarbstoff Sulforhodamin B (SRB) als Verkapselungsmaterial verwendet, das sowohl den Fluoreszenz- als auch den kolorimetrischen Nachweis ermöglicht.
Der erste experimentelle Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung eines Surrogat-Virusneutralisationstests für SARS-CoV-2, der sowohl für Hochdurchsatz-Screening (HTS) als auch für Point-of-Care-Tests (POCT) verwendet werden kann. Dieses Ziel wurde durch die einfache Modifizierung von SRB-Liposomen mit der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) von SARS-CoV-2 unter Verwendung von EDC/Sulfo-NHS-Chemie erreicht. Mit dem mikroplattenbasierten HTS-Assay konnten neutralisierende anti-RBD Antikörper quantitativ nachgewiesen werden, und die erhaltenen IC50-Werte korrelierten hervorragend mit denen eines etablierten Pseudovirus-Neutralisationstests (pVNT) (r = 0.847). Das POC-Format zeigte ebenfalls eine gute Korrelation zum pVNT (r = 0.614) und ermöglichte den schnellen qualitativen Nachweis von neutralisierenden Antikörpern. Darüber hinaus wurde eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem HTS- und dem POC-Format beobachtet (r = 0.868), was den Vorteil der Verwendung eines einzigen Signalkonjugats für zwei unabhängige Assays mit unterschiedlichen Nachweismethoden unterstreicht. Während die ursprünglichen Studien zur Lagerstabilität eine Aggregation und einen Verlust der Bindungsfähigkeit an den Angiotensin-Converting-Enzym-2-Rezeptor (ACE2) innerhalb der ersten Wochen ergaben, konnte eine weitere Optimierung sowohl die kolloidale als auch die Proteinstabilität der RBD-modifizierten Liposomen verbessern, was ihre Verwendung für bis zu 24 Wochen ermöglicht.
Der zweite Teil befasst sich mit verschiedenen Konjugationsstrategien für Proteine an Liposomen. Die Modifizierung von Liposomen mit RBD verschiedener SARS-CoV-2-Varianten mittels EDC/sulfo-NHS Chemie führte im Falle der Omicron-Varianten aufgrund von Mutationen zu einer ungünstigen Ausrichtung, die eine Interaktion mit ACE2 verhindert. Alternativ wurde die Konjugation verschiedener Varianten des stabilisierten trimeren Spike-Proteins untersucht, was sich jedoch als schwierig erwies, da es bei der Modifikation zu Aggregation oder zum Austritt von SRB kam. Es wurden verschiedene Biotinylierungsstrategien für RBD untersucht, um stattdessen die Verwendung von Streptavidin-konjugierten Liposomen zu ermöglichen, die eine getrennte Lagerung der Testkomponenten sowie einen einfachen Austausch des konjugierten Proteins erlauben. Die zufällige Biotinylierung von Aminogruppen sowohl des N-Terminus als auch von Lysinresten mit NHS-Biotin erwies sich als machbar. Bessere Ergebnisse wurden durch die ortsgerichtete Biotinylierung eines Cys-Tags unter Verwendung von Maleimid-Biotin-Konjugaten erzielt, die die Einführung von Spacern wie Polyethylenglykol ermöglichen. Die ortsgerichtete enzymatische Biotinylierung eines Avi-Tags lieferte die besten Ergebnisse und konnte auf alle fünf untersuchten RBD-Varianten angewandt werden, wobei sie sich durch ihre hohe Konstanz auszeichnete. Die Feinabstimmung führte zur Entwicklung eines hochempfindlichen HTS-Neutralisationstests für jede Variante. Die Cut-off-Werte wurden anhand von fünf seronegativen Proben bestimmt, anschließend wurden 10 seropositive Proben getestet. Letztere verdeutlichten die Immunflucht der Omicron-Varianten, die im Vergleich zu Alpha und Delta insgesamt niedrigere IC50-Werte aufwiesen. Die erhaltenen IC50-Werte korrelierten gut mit dem pVNT (r = 0.86). Durch die Verwendung von Neutravidin anstelle von Streptavidin werden unspezifische Wechselwirkungen mit Proteinen, die die RGD-Sequenz enthalten, vermieden, was das Format zu einer vielseitigen Plattformtechnologie macht, die leicht an andere Proteine angepasst werden kann.
Im letzten Teil werden Strategien zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Benutzerfreundlichkeit des POC-Neutralisationstests untersucht. Die RBD-Beladung, die Serumkonzentration und die Breite des LFA-Streifens erwiesen sich als Schlüsselfaktoren. Darüber hinaus wurden Strategien für die Inkubation auf dem Streifen untersucht, darunter eine Polyvinylalkohol-Barriere und eine Wachsbarriere mit Spalt, um die Benutzerfreundlichkeit von POC-Diagnosetests insgesamt zu verbessern. Schließlich wurde versucht, neutralisierte RBD-Liposomen mit Hilfe einer zweiten Testlinie, bestehend aus Anti-Human-Ig Antikörpern oder Protein A, einzufangen, um einen „Signal-on“-Ansatz zu ermöglichen. Die unspezifische Wechselwirkung von HSA mit Antikörpern und die Fülle anderer Antikörper, die nicht gegen RBD gerichtet sind, wurden als Haupthindernisse für die Umsetzung dieses Ansatzes ermittelt.
Metadaten zuletzt geändert: 05 Aug 2025 08:52
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