| License: Creative Commons Attribution 4.0 (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-374426
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.37442
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 19 June 2019 |
| Referee: | Prof. Dr. Gernot Längst |
| Date of exam: | 19 June 2018 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Gernot Längst |
| Keywords: | MicroScale Thermophoresis, dissociation constant, affinity |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Partially |
| Item ID: | 37442 |
Abstract (English)
The analysis of molecular binding events is of great importance for both basic research and drug development. Several biophysical methods can be applied for the characterization of interactions, regarding affinity, kinetics or thermodynamic parameters. One commonly applied biophysical method is label-free MicroScale Thermophoresis (MST), which provides Kd determination under label-free and ...
Abstract (English)
The analysis of molecular binding events is of great importance for both basic research and drug development. Several biophysical methods can be applied for the characterization of interactions, regarding affinity, kinetics or thermodynamic parameters. One commonly applied biophysical method is label-free MicroScale Thermophoresis (MST), which provides Kd determination under label-free and in-solution conditions. This method utilizes the intrinsic fluorescence of tryptophan, an amino acid incorporated in the vast majority of proteins. Up to now, label-free MST was restricted to quantification of interactions in which only one binding partner exhibits fluorescence in the detection wavelength. This excludes proteins as second binding partners, along with a significant number of small molecules or fragments. The reason for this is that preferred scaffolds used for the synthesis of small molecules and fragments often include indole or similar ring systems, which lead to fluorescence interference in label-free MST assays. Because of these reasons, the main goal of this thesis was to explore approaches which would enable a broader applicability of label-free MST and facilitate the quantification of intermolecular interactions under close-to-native MST-based experimental conditions.
In a first approach, a modified emission filter was tested to potentially cut off any unwanted signal arising from interfering compounds to a higher extent compared to the established filter. The modified emission bandwidth indeed decreased the extent of fluorescence interference caused by compounds. However, as many compounds exhibit so-called privileged structures, such as indole motifs which are also present in tryptophan residues of proteins, the number of compounds that still interfere in label-free assays highly depends on the compound library used and remains hard to predict, as different chemical substituents can already drastically alter the emission spectrum of compounds.
As this modification of the device´s optical system did not provide an overall solution for interfering compounds and in addition could not be used for the analysis of protein-protein interactions (PPIs), a second strategy was developed. Here, a composition gradient titration strategy in combination with data analysis based on a least-mean-square approximation was applied for the quantification of PPIs in a label-free MST approach. The obtained Kd values were in good agreement with data obtained from standard (= non-label-free) MST experiments. Although in general, this approach was suitable for the quantification of PPIs, simulations of various experimental conditions revealed several limitations and restrictions regarding proteins´ fluorescence intensities, Fnorm values and start concentrations in general.
Due to the limitations of both strategies, a compromise strategy between preserving the proteins´ native structure as much as possible, while at the same time making use of the advantages of a fluorescent tag was applied. Therefore, target proteins were site-specifically labeled at their His6-tag using tris-NTA fluorophores, which was found to provide robust results for both, protein-small molecule and PPIs. Using such a site-specific labeling approach, the proteins´ native structure is highly preserved and interference of fluorophores with ligand binding is prevented. Among three different fluorophores tested, RED-tris-NTA proved to be the most suitable dye for this purpose. Furthermore, this approach offered the possibility to directly measure MST in crude cell lysate, which further increased the close-to-native format. In addition, such measurements wouldn´t be possible using label-free MST, which further highlights the advantages of the site-specific labeling approach.
Translation of the abstract (German)
Die Analyse molekularer Interaktionen ist von großer Bedeutung für die Grundlagenforschung und für die Entwicklung neuer Arzneistoffe. Für ihre Charakterisierung stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, mit denen Affinität, Kinetik oder auch thermodynamische Parameter analysiert werden können. Eine dieser Methoden ist markierungsfreie mikroskalierte Thermophorese (MST), mit der Kds ...
Translation of the abstract (German)
Die Analyse molekularer Interaktionen ist von großer Bedeutung für die Grundlagenforschung und für die Entwicklung neuer Arzneistoffe. Für ihre Charakterisierung stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, mit denen Affinität, Kinetik oder auch thermodynamische Parameter analysiert werden können. Eine dieser Methoden ist markierungsfreie mikroskalierte Thermophorese (MST), mit der Kds markierungsfrei und frei in Lösung bestimmt werden können. Dafür verwendet diese Methode die Fluoreszenz von Tryptophan, einer Aminosäure, die in den meisten Proteinen vorkommt. Bisher war diese Methode auf die Analyse von Interaktionen beschränkt, bei denen nur einer der beiden Bindungspartner in dem detektierten Wellenlängenbereich fluoresziert. Damit waren nicht nur Protein-Protein Interaktionen (PPI) von der Analyse ausgeschlossen, sondern auch eine große Anzahl an kleinen Molekülen und Fragmenten. Der Grund dafür ist, dass viele dieser kleinen Moleküle und Fragmente sogenannte privilegierte Strukturen wie Indole oder ähnliche Ringstrukturen aufweisen, was zur Fluoreszenzüberschneidung führt. Daher war das Hauptziel dieser Dissertation Möglichkeiten zu finden, die ein breiteres Anwendungsspektrum der markierungsfreien MST ermöglichen und dabei weiterhin die Quantifizierung von Interaktionen in einem nahezu nativen Zustand ermöglichen.
In einem ersten Ansatz wurde ein veränderter Emissionsfilter getestet, der die ungewollte Detektion von Fluoreszenzsignalen der Interaktionspartner reduzieren sollte. Tatsächlich konnte durch diesen Filter der Grad an Fluoreszenzüberschneidung gesenkt werden. Allerdings weisen viele chemische Verbindungen privilegierte Strukturen wie Indole auf, die auch Teil des Tryptophans sind. Daher ist der Grad an Signalüberlappung stark von der Substanzbibliothek abhängig und die Vorhersagbarkeit über das Ausmaß an Signalüberschneidung bleibt schwierig, da kleinste Modifikationen der chemischen Struktur dieser Substanzen bereits drastisch deren Emissionsspektrum verändern können.
Da der neue Filter also keine generelle Lösung darstellte und auch nicht für die Analyse von PPI verwendet werden kann, wurde eine zweite Strategie entwickelt. Dabei wurde eine Mischungsgradienten-Titration (Englisch: composition gradient titration (CGT)) zusammen mit einer auf den kleinsten mittleren Quadraten basierten Datenanalyse für die Charakterisierung von PPI angewandt. Obwohl dieser Ansatz prinzipiell dafür geeignet war PPI zu quantifizieren, zeigten Simulationen einer Vielzahl an experimentellen Bedingungen, dass dieser Ansatz Limitationen in Hinsicht auf Fluoreszenzintensität, Fnorm Wert und Startkonzentration der verwendeten Proteine hat.
Aufgrund der Nachteile beider Ansätze, wurde ein Kompromiss zwischen der Erhaltung der nativen Struktur des Proteins einerseits und den Vorteilen einer Fluoreszenzmarkierung andererseits gesucht. Um das zu erreichen wurde das Protein orts-spezifisch mit einem tris-NTA Farbstoff fluoreszenzmarkiert, was robuste Messungen von sowohl PPI als auch Protein-Ligand Interaktionen ermöglichte. Durch die orts-spezifische Markierung bleibt die native Struktur des Proteins erhalten und eine mögliche Beeinträchtigung der Ligandbindung durch Farbstoffmoleküle ist weitestgehend ausgeschlossen. Unter verschiedenen getesteten Fluorophoren erwies sich RED-tris-NTA als für diese Anwendung am besten geeignet. Darüber hinaus konnte dieser Ansatz für MST Messungen in Zelllysat verwendet werden, was zusätzlich den nahezu nativen Charakter dieses Ansatzes erhöht. Dies wäre mit markierungsfreier MST nicht möglich gewesen und stellt damit einen weiteren Vorteil dar.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 19:35
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