Understanding Archaea-type Ether Lipids - searching for new derivatives in Bacteria and Archaea, functional studies on Geranylgeranylglyceryl Phosphate Synthase
A trademark of Archaea is their exclusive membrane lipid composition. They possess so-called ether lipids that differ from bacterial ones in three characteristics: (i) isoprenoid chains, commonly C20, are connected to (ii) sn-glycerol 1-phosphate (G1P) by (iii) ether linkages. These characteristics are introduced by the geranylgeranylglyceryl phosphate synthase (GGGPS) which catalyzes the ...
Zusammenfassung (Englisch)
A trademark of Archaea is their exclusive membrane lipid composition. They possess so-called ether lipids that differ from bacterial ones in three characteristics: (i) isoprenoid chains, commonly C20, are connected to (ii) sn-glycerol 1-phosphate (G1P) by (iii) ether linkages. These characteristics are introduced by the geranylgeranylglyceryl phosphate synthase (GGGPS) which catalyzes the condensation of G1P and the isoprenoid. The GGGPS has been considered exclusive for the archaeal domain, therefore it was surprising when homologues were found in Bacillus subtilis, followed by the identification of Archaea-type ether lipids. However, these ether lipids are different to their archaeal counterparts: They consist of one C35 isoprenoid chain and instead of addition of a second chain, the glycerol is diacetylated by the O-acetyltransferase YvoF. GGGPS enzymes have also been found in Bacteroidetes and in phylogenetic studies the GGGPS enzyme family was clustered into two groups, both containing archaea and bacteria, with dimeric enzymes in group I and dimers as well as hexamers in group II.
The first part of this thesis deals with the characterization of group II GGGPS predecessors, in order to retrace evolution of the GGGPS. For this purpose, ancestral enzymes that were calculated previously in an ancestral sequence reconstruction approach, were examined for their oligomerization state and stability. Results imply that the hexamer must have developed early and that dimeric GGGPS enzymes in this group have evolved from the hexamer. However, the fine-tuning of the flexibilization, which can be observed for some GGGPS enzymes, developed late. It is assumed that this flexibilization might provide high activity in a rigid, stability-ensuring backbone. In addition, characterization of predecessors provided information about the oligomerization state of modern GGGPS enzymes that have not been purified so far.
In the second part, I present a proof-of-concept in which the oligomerization state of the GGGPS was selectively modulated by external input to gain control over enzymatic activity. This was performed for priorly dimerized modern and ancestral GGGPS enzymes. As those dimerized variants exhibited no or very low enzymatic activity, the implementation of a switch for the oligomerization state also allowed switching of activity. Hexameric GGGPS enzymes have a cation-π bond in the hexamerization interface between neighboring protomers, which was converted into a molecular switch using chemical rescue and optical control. The former aimed at the cationic residue of the bond and the latter targeted the aromate. Both strategies were used successfully to selectively hexamerize the GGGPS enzymes and thus gain control over enzymatic activity.
The third part presents experiments that aimed to contribute to understanding the function of ether lipid derivatives in Bacteria and Halobacteria (Archaea). Quantification of ether lipids in B. subtilis using mass spectrometry (MS) indicated that the proportion is rather small. Furthermore, MS was performed to find ether lipids in Bacteroidetes, which failed, however, we tentatively identified a variety of acetylated diether lipids in Halobacteria inspired by previous studies that discussed an occurrence of YvoF in Halobacteria.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ein Markenzeichen von Archaea ist ihre exklusive Membranlipidzusammensetzung. Sie besitzen so genannte Etherlipide, die sich von den bakteriellen Lipiden durch drei Merkmale unterscheiden: (i) Isoprenoidketten, in der Regel C20, sind mit (ii) sn-Glycerin-1-Phosphat (G1P) über (iii) Etherbindungen verknüpft. Diese drei Attribute werden durch die Geranylgeranylglycerylphosphat Synthase (GGGPS) ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ein Markenzeichen von Archaea ist ihre exklusive Membranlipidzusammensetzung. Sie besitzen so genannte Etherlipide, die sich von den bakteriellen Lipiden durch drei Merkmale unterscheiden: (i) Isoprenoidketten, in der Regel C20, sind mit (ii) sn-Glycerin-1-Phosphat (G1P) über (iii) Etherbindungen verknüpft. Diese drei Attribute werden durch die Geranylgeranylglycerylphosphat Synthase (GGGPS) eingeführt, welche die Kondensation von G1P und dem Isoprenoid katalysiert. Die GGGPS wurde als exklusiv für die Domäne der Archaeen angesehen, daher war es überraschend, als Homologe in Bacillus subtilis gefunden wurden, gefolgt von der Identifizierung von Archaea-typischen Etherlipiden in diesem Organismus. Diese Etherlipide unterscheiden sich jedoch von denen in Archaeen: Sie bestehen aus einer C35-Isoprenoidkette und es wird keine zweite Isoprenoidkette hinzugefügt, sondern das Glycerin wird durch die O-Acetyltransferase YvoF diazetyliert. GGGPS Enzyme wurden auch in Bacteroidetes gefunden und phylogenetische Studien zeigten, dass die GGGPS Enzymfamilie in zwei Gruppen aufgeteilt werden kann, welche beide Archaeen und Bakterien enthalten, mit ausschließlich dimeren Enzymen in Gruppe I und Dimeren sowie Hexameren in Gruppe II.
Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung von GGGPS Vorläufern der Gruppe II, um die Evolution dieses Enzyms zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden die Vorläuferenzyme, die zuvor in einem "Anzestrale Sequenz Rekonstruktion" Ansatz berechnet wurden, bezüglich ihres Oligomerisierungsgrades und ihrer Stabilität hin untersucht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der hexamere Oligomerisierungsgrad früh entstanden sein muss und dass sich dimere GGGPS Enzyme in dieser Gruppe aus dem Hexamer entwickelt haben. Die Feinabstimmung der Flexibilisierung, die bei einigen GGGPS Vertretern auftritt, hat sich jedoch erst spät entwickelt. Es wird angenommen, dass diese Flexibilisierung für eine hohe Aktivität sorgt in einem sonst starren und stabilen Rückgrat. Darüber hinaus lieferte die Charakterisierung von Vorläufern Informationen über den Oligomerisierungsgrad moderner GGGPS-Enzyme, die bisher noch nicht gereinigt wurden.
Im zweiten Teil stelle ich ein „Proof-of-Concept“ vor, in welchem der Oligomerisierungsgrad der GGGPS selektiv durch externen Input moduliert wurde, um die enzymatische Aktivität zu kontrollieren. Dies wurde für zuvor dimerisierte moderne und anzestrale GGGPS Enzyme durchgeführt. Da dimerisierte Varianten keine oder eine nur sehr geringe enzymatische Aktivität aufwiesen, ermöglichte die Implementierung eines Schalters für den Oligomerisierungsgrad auch die Schaltung der Aktivität. Hexamere GGGPS Enzyme besitzen eine Kation-π Bindung im Hexamerisierungsinterface, welche zwischen benachbarten Protomeren eine stabilisierende Bindung darstellt. Diese wurde mit Hilfe von „chemical rescue“ und „optical control“ in einen molekularen Schalter umgewandelt. Ersteres zielte auf den kationischen Rest der Bindung, letztere auf den Aromaten ab. Beide Strategien wurden erfolgreich implementiert: Die GGGPS Enzyme konnten selektiv hexamerisiert und so in ihrer enzymatischen Aktivität geschalten werden.
Im dritten Teil werden Experimente vorgestellt, die zum Verständnis der Funktion von Etherlipid-Derivaten in Bakterien und Halobakterien (Archaea) beitragen sollen. Die Quantifizierung von Etherlipiden in B. subtilis mittels Massenspektrometrie (MS) zeigte, dass der Anteil eher gering ist. Darüber hinaus wurde MS durchgeführt, um Etherlipide in Bacteroidetes zu finden, was jedoch fehlschlug. In Anlehnung an frühere Studien, in denen ein Vorkommen von YvoF in Halobakterien diskutiert wurde, identifizierten wir eine Vielzahl von azetylierten Dietherlipiden in Halobakterien.
![[img]](https://epub.uni-regensburg.de/style/images/fileicons/other.png)
Downloadstatistik