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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-528529
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.52852
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 September 2023 |
| Referee: | PD Dr. Andrea Straßer |
| Date of exam: | 30 August 2022 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Projects (Historical): | GRK 1910, Graduiertenkolleg "Medicinal Chemistry of Selective GPCR Ligands" |
| Keywords: | GPCR, Mini-G protein, Split luciferase complementation, Ligand characterization, Coupling profiles, CRISPR/Cas9, Gaussian accelerated molecular dynamics |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 52852 |
Abstract (English)
In GPCR research, there is great interest in developing high-affinity and selective ligands as pharmacological tools and ultimately as drugs. Traditionally, G protein-dependent functional responses have been assessed in [35S]GTP-gamma-S binding assays reporting on the degree of G protein activation in response to agonists by the accumulation of nonhydrolyzable [35S]GTP-gamma-S bound to G-alpha. ...
Abstract (English)
In GPCR research, there is great interest in developing high-affinity and selective ligands as pharmacological tools and ultimately as drugs. Traditionally, G protein-dependent functional responses have been assessed in [35S]GTP-gamma-S binding assays reporting on the degree of G protein activation in response to agonists by the accumulation of nonhydrolyzable [35S]GTP-gamma-S bound to G-alpha. However, [35S]GTP-gamma-S binding assays are confounded by the use of radionucleotides, the non-homogenous performance and low assay signal amplitudes that represent a major drawback for weakly expressed GPCRs. Therefore, the primary aim of this thesis was the development of an alternative G protein assay, which should overcome the latest disadvantages of [35S]GTP-gamma-S binding assays and, in particular, be amenable to weakly expressed GPCRs, such as the histamine H4 receptor.
In 2018, the utility of engineered mini-G proteins in live cell assays in addition to stabilizing active GPCR conformations for crystallization purposes was demonstrated by Wan and co-workers. Motivated by the idea that the cytosolic nature of mini-G proteins in combination with the split-luciferase complementation (SLC) principle should improve assay sensitivity (i.e., signal-to-noise ratio) and signal-to-background (S/B) ratios compared to G protein sensors that make use of membrane-bound G proteins resulting in high background signals due to pre-association with GPCRs, SLC-based mini-G protein sensors were developed. For this purpose, the sequences encoding split-NanoLuc fragments, NlucC and NlucN, were fused to the C-termini of receptors and the N-termini of the mini-G proteins, mGs, mGsi and mGsq, respectively. In response to agonists, receptor conformational change promoted the recruitment of the corresponding mini-G protein, allowing the reconstitution of a functional luciferase. Advantageously, released bioluminescence, which was proportional to the amount of activated receptor, could be measured in real time. In particular, the use of the bright split-NanoLuc luciferase allowed for the investigation of weakly expressed receptors.
One subproject of this thesis was dedicated to the development of mini-G protein sensors for the histamine receptor (HR) family comprising H1R, H2R, and H3,4R (cf. Chapter 2), since these receptors have constituted well-studied drug targets at the institute. To demonstrate the suitability of mini-G protein recruitment assays for the pharmacological characterization of ligands as alternative to [35S]GTP-gamma-S binding assays, H1R/mGsq, H2R/mGs and H3,4R/mGsi sensors were characterized in detail. In general, excellent assay quality was obtained, including significantly higher signal amplitudes (H1R: 12.56, H2R: 4.39, H3R: 6.61, H4R: 1.75 fold over [35S]GTP-gamma-S) and Z' factors between 0.5 and 1.0 (H1R: 0.78 ± 0.07, H2R: 0.85 ± 0.02, H3R: 0.79 ± 0.04, H4R: 0.68 ± 0.05; cf. Chapter 2). Moreover, developed sensors served for the pharmacological characterization of standard agonists and antagonists as well as example ligands, which were synthesized at the institute (UR-KUM530, UR-PI294).
Subsequently, the assay concept was applied to other GPCRs of interest at the institute, including dopamine D1,2,5 receptors, muscarinic acetylcholine M1,2,4,5 receptors, neuropeptide Y Y2,4 receptors, the neurotensin NTS1 receptor and the chemokine receptor CXCR4 (cf. Chapter 3). It is worth mentioning that the mGsi assay was the first assay available for CXCR4 at the institute, thus now offering the opportunity to characterize potential CXCR4 ligands, the development of which has recently become a research project in our laboratory. The determination of binding sites per cell in radioligand binding assays revealed that the receptor number did not correlate with obtained signal amplitudes, suggesting that each receptor provided an individual mini-G protein turnover. Furthermore, the mini-G protein sensor reversibility was confirmed by demonstrating that SLC responses could be completely blocked in all systems after the agonist has been displaced by an antagonist.
Since mini-G protein recruitment assays could be performed at low level receptor density recombinantly expressed in cells (~40,000 binding sites per cell, e.g., for H3R and M2R), it was of interest to determine whether mini-G protein sensors would detect the activation of endogenously expressed receptors (cf. Chapter 4). For this purpose, CRISPR/Cas9 experiments were designed for attaching the small split-Nanoluc fragment, NlucC, to endogenous beta1,2AR in HEK293T cells. Albeit, most likely not all gene loci of the utilized aneuploid HEK293T cells were modified by CRISPR/Cas9 reactions, mGs sensors were able to report on the activation of beta1,2AR-NlucC at the endogenous receptor level. Despite significantly lower signal amplitudes (S/B) compared with overexpressed sensors, mGs sensors specifically recognized receptor activation in response to full and partial agonists at the endogenous receptor level. In the future, the generation of beta1,2AR-NlucC fusion proteins under endogenous promotion should enable the evaluation of other signal transducer interactions, including beta-arrestins, G protein-coupled receptor kinases (GRKs), or mini-G proteins of other G-protein families, when fused to NlucN.
Another subproject of this thesis was dedicated to the elucidation of GPCR – G protein coupling profiles using mini-G protein sensors (cf. Chapter 5). Due to the chimeric nature of mini-G proteins, it was of particular interest to examine whether obtained coupling profiles were consistent with reported interactions. Since a correlation between assay signal amplitudes and mini-G protein expression was observed for histamine receptors in Chapter 2, the amounts of plasmid DNA used were optimized to obtain comparable protein expression in HEK293T cells after transient transfection. Overall, 22 GPCRs were characterized and, in addition to appropriate primary G protein coupling, strong secondary interaction was obtained for D1R, adenosine A2B receptor, H1R, M1R, M5R and NTS1R with mGsi. In future projects, it may be of interest to determine whether the observed GPCR - G protein coupling profiles can be altered by ligands, thus providing a drug target.
In a computer-based approach, the dynamics of mini-G protein binding were assessed more in detail for H2R and H4R using Gaussian accelerated molecular dynamics (GaMD) simulations. In GaMD, a harmonic boost potential is applied to the system to cross high energy barriers and thus allow the system to achieve another conformation. Overall, the canonical systems, H2R-mGs and H4R-mGsi, were the most stable systems and the weaker coupled systems, H2R-mGsi and H2R-mGsq were more dynamic. With the knowledge from the mini-G protein recruitment assays that H2R interacted with both mGs, mGsi, and mGsq, the observation that all mini-G proteins occupied a Gs-like position in complex with H2R gained significance. In agreement with the hypothesis that GPCRs accommodate G proteins in a designated position, GaMD revealed that mGs and mGsq, in contrast to mGsi, could not occupy the Gi-like position at H4R, which exclusively coupled to mGsi in mini-G recruitment assays.
In summary, a modern G protein-dependent assay platform has been established for the functional characterization of ligands at a total of 22 different GPCRs. Not least, its usefulness for pharmacological testing is highlighted by the fact that the mini-G protein recruitment concept has become widely accepted in drug discovery during the preparation of this thesis. In addition to the development of protocols for the routine testing of full, partial and inverse agonists as well as antagonists, assay and data analysis protocols have been established for the investigation of GPCR – G protein coupling profiles under uniform mini-G protein expression levels. In addition, the computational analysis of H2,4R coupling profiles to mGs, mGsi, and mGsq using GaMD simulations provided dynamic insight into the respective complex formation and suggested that GPCRs need to allow a specific orientation of the G protein in the receptor binding cavity (e.g., in a Gs- or Gi-like position) as a prerequisite for successful coupling. Ultimately, as a proximal G protein-dependent cell assay of high quality, the mini-G protein recruitment assay should be well suited to assess structure-activity relationships of ligands in terms of pathway bias for different types of G proteins or beta-arrestins, optionally at the endogenous receptor level.
Translation of the abstract (German)
In der GPCR-Forschung besteht ein großes Interesse an der Entwicklung hochaffiner und selektiver Liganden als pharmakologische Werkzeuge und als Arzneimittel. Klassischerweise wurden G-Protein-basierte funktionelle Zellantworten in [35S]GTP-gamma-S-Bindungsassays untersucht, die den Grad der G-Protein-Aktivierung durch Agonisten anhand Akkumulation von an G-alpha gebundenem, ...
Translation of the abstract (German)
In der GPCR-Forschung besteht ein großes Interesse an der Entwicklung hochaffiner und selektiver Liganden als pharmakologische Werkzeuge und als Arzneimittel. Klassischerweise wurden G-Protein-basierte funktionelle Zellantworten in [35S]GTP-gamma-S-Bindungsassays untersucht, die den Grad der G-Protein-Aktivierung durch Agonisten anhand Akkumulation von an G-alpha gebundenem, nicht-hydrolysierbarem [35S]GTP-gamma-S messen. Allerdings werden [35S]GTP-gamma-S-Bindungsassay durch die Verwendung von Radionukleotiden, eine nicht-homogene Durchführung und geringe Signalamplituden beeinträchtigt, was gerade bei schwach exprimierten GPCRs ein großer Nachteil ist. Somit bestand das Hauptziel dieser Arbeit in der Entwicklung eines alternativen G-Protein-Assays, der die genannten Nachteile des [35S]GTP-gamma-S-Bindungsassays überwindet und sich insbesondere für schwach exprimierte GPCRs, wie den Histamin H4 Rezeptor, eignet.
2018 demonstrierten Wan et al. den Nutzen von Mini-G-Proteinen in Lebendzellassays und zur Stabilisierung aktiver GPCR-Konformationen zu Kristallisationszwecken. Motiviert durch die Idee, dass die zytosolische Natur der Mini-G-Proteine in Kombination mit dem Split-Luziferase-Komplementierungs (SLC)-Prinzip die Assay-Empfindlichkeit (d. h. das Signal-Rausch-Verhältnis) und das Signal-Hintergrund-Verhältnis (S/B) verbessern sollte im Vergleich zu klassischen G-Protein-Sensoren, bei denen die Vorassoziation von GPCRs und membrangebundenen G-Proteinen zu hohen Hintergrundsignalen führt, wurden SLC-basierte Mini-G-Protein-Sensoren entwickelt. Zu diesem Zweck wurden die Sequenzen, die für die Split-NanoLuc-Fragmente NlucC und NlucN kodieren, mit den C-Termini der Rezeptoren bzw. den N-Termini der Mini-G-Proteine mGs, mGsi und mGsq fusioniert. Als Reaktion auf Agonisten förderte die Konformationsänderung des Rezeptors die Rekrutierung des entsprechenden Mini-G-Proteins, was die Rekonstitution einer funktionellen Luziferase ermöglichte. Dabei konnte die freigesetzte Biolumineszenz, die proportional zur Menge des aktivierten Rezeptors war, in Echtzeit vermessen werden. Insbesondere die Verwendung der hellen Split-NanoLuc ermöglichte die Untersuchung von schwach exprimierten Rezeptoren.
Ein Teilprojekt dieser Arbeit widmete sich der Entwicklung von Mini-G-Protein-Sensoren für die Histamin Rezeptor (HR)-Familie, bestehend aus H1R, H2R und H3,4R (vgl. Kapitel 2), da diese Rezeptoren gut untersuchte Wirkstoffziele am Institut darstellen. Um die Eignung von Mini-G-Protein-Rekrutierungsassays für die pharmakologische Charakterisierung von Liganden als Alternative zu [35S]GTP-gamma-S-Bindungsassays zu demonstrieren, wurden H1R/mGsq-, H2R/mGs- und H3,4R/mGsi-Sensoren im Detail charakterisiert. Im Allgemeinen wurde eine hervorragende Assay-Qualität erzielt, einschließlich deutlich erhöhter Signalamplituden (H1R: 12,56-, H2R: 4,39-, H3R: 6,61-, H4R: 1,75-fach über [35S]GTP-gamma-S) und Z'-Faktoren zwischen 0,5 und 1,0 (H1R: 0,78 ± 0,07, H2R: 0,85 ± 0,02, H3R: 0,79 ± 0,04, H4R: 0,68 ± 0,05; vgl. Kapitel 2). Darüber hinaus dienten die entwickelten Sensoren zur pharmakologischen Charakterisierung von Standard-Agonisten und -Antagonisten sowie von Liganden, die am Institut synthetisiert wurden (UR-KUM530, UR-PI294).
Anschließend wurde das Assay-Konzept auf weitere am Institut untersuchte GPCRs angewandt, darunter Dopamin D1,2,5 Rezeptoren, muskarinische Acetylcholin M1,2,4,5 Rezeptoren, Neuropeptid Y Y2,4 Rezeptoren, der Neurotensin NTS1 Rezeptor und der Chemokin Rezeptor CXCR4 (vgl. Kapitel 3). Erwähnenswert ist, dass der mGsi-Assay der erste Assay ist, der nun am Institut für CXCR4 zur Verfügung steht, und somit die Möglichkeit bietet, potenzielle CXCR4 Liganden zu charakterisieren, deren Entwicklung kürzlich zu einem Forschungsprojekt in unserem Labor geworden ist. Die Bestimmung der Bindungsstellen pro Zelle in Radioligand-Bindungsassays ergab, dass die Anzahl der Rezeptoren nicht mit den erzielten Signalamplituden korreliert, was darauf hindeutet, dass jeder Rezeptor einen individuellen Mini-G-Protein-Umsatz liefert. Darüber hinaus wurde die Reversibilität des Mini-G-Protein-Sensors bestätigt, indem gezeigt wurde, dass die SLC-Antworten in allen Systemen vollständig blockiert werden konnten, nachdem der Agonist durch einen Antagonisten verdrängt worden war.
Da Mini-G-Protein-Rekrutierungstests auch bei niedriger Rezeptordichte an rekombinanten Zellen durchgeführt werden konnten (~40.000 Bindungsstellen pro Zelle, z. B. für H3R und M2R), war es von Interesse zu bestimmen, ob Mini-G-Protein-Sensoren die Aktivierung endogen exprimierter Rezeptoren detektieren würden (vgl. Kapitel 4). Zu diesem Zweck wurden CRISPR/Cas9-Experimente entworfen, um das kleine Split-Nanoluc-Fragment NlucC an endogene Beta1,2 Adrenozeptoren (Beta1,2AR) in HEK293T-Zellen zu fusionieren. Obwohl höchstwahrscheinlich nicht alle Genorte der verwendeten aneuploiden HEK293T-Zellen durch CRISPR/Cas9-Reaktionen modifiziert wurden, konnten die mGs-Sensoren die Aktivierung von Beta1,2AR-NlucC auf der Ebene des endogenen Rezeptors anzeigen. Trotz deutlich geringerer Signalamplituden (S/B) im Vergleich zu überexprimierten Sensoren erkannten mGs-Sensoren spezifisch die Rezeptoraktivierung durch volle und partielle Agonisten auf endogenem Rezeptorlevel. In Zukunft sollte die Erstellung von Beta1,2AR-NlucC-Fusionsproteinen auf endogenem Level auch die Analyse anderer Rezeptor-Interaktionen ermöglichen, z.B. mit Beta-Arrestinen, G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) oder Mini-G-Proteinen anderer G-Protein-Familien, sofern diese mit NlucN fusioniert sind.
Ein weiteres Teilprojekt dieser Arbeit widmete sich der Aufklärung von GPCR-G-Protein-Kopplungsprofilen unter Verwendung von Mini-G-Protein-Sensoren (vgl. Kapitel 5). Aufgrund der chimären Natur der Mini-G-Proteine war es von besonderem Interesse zu untersuchen, ob die erhaltenen Kopplungsprofile mit den berichteten Wechselwirkungen übereinstimmen. Da in Kapitel 2 für Histamin Rezeptoren eine Korrelation zwischen den Signalamplituden des Assays und der Expression der Mini-G-Proteine beobachtet wurde, wurden die verwendeten Mengen an Plasmid-DNA optimiert, um nach transienter Transfektion eine vergleichbare Proteinexpression in HEK293T-Zellen zu erhalten. Insgesamt wurden 22 GPCRs charakterisiert, und zusätzlich zur geeigneten primären G-Protein-Kopplung wurde eine starke sekundäre Interaktion für D1R, Adenosin A2B Rezeptor, H1R, M1R, M5R und NTS1R mit mGsi erzielt. In zukünftigen Projekten könnte es von Interesse sein, zu bestimmen, ob die beobachteten GPCR-G-Protein-Kopplungsprofile durch Liganden verändert werden können.
In einem computergestützten Ansatz wurde die Dynamik der Mini-G-Protein-Bindung für H2R und H4R mit Hilfe von Gaussian Accelerated Molecular Dynamics (GaMD)-Simulationen detaillierter untersucht. Bei GaMD wird ein harmonisches Verstärkungspotential auf das System angewandt, um hohe Energiebarrieren zu überwinden und dem System so zu ermöglichen, eine andere Konformation zu erreichen. Insgesamt waren die kanonischen Systeme, H2R-mGs und H4R-mGsi, die stabilsten Systeme und die schwächer gekoppelten Systeme, H2R-mGsi und H2R-mGsq, waren dynamischer. Mit dem Wissen aus den Mini-G-Protein-Rekrutierungstests, dass H2R sowohl mit mGs, mGsi als auch mGsq interagiert, gewann die Beobachtung, dass alle Mini-G-Proteine eine Gs-ähnliche Position im Komplex mit H2R einnahmen, an Bedeutung. In Übereinstimmung mit der Hypothese, dass GPCRs G-Proteine in einer bestimmten Position binden, zeigte GaMD, dass mGs und mGsq, im Gegensatz zu mGsi, die Gi-ähnliche Position an H4R nicht besetzen konnten, das in Mini-G-Rekrutierungstests ausschließlich an mGsi gekoppelt war.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine moderne G-Protein-abhängige Assay-Plattform für die funktionelle Charakterisierung von Liganden an insgesamt 22 verschiedenen GPCRs etabliert wurde. Ihre Nützlichkeit für pharmakologische Assays wird nicht zuletzt dadurch unterstrichen, dass sich das Konzept der Mini-G-Protein-Rekrutierung während der Erstellung dieser Arbeit in der Arzneimittelforschung weitgehend durchgesetzt hat. Neben der Entwicklung von Protokollen für die Routine-Charakterisierung von vollen, partiellen und inversen Agonisten sowie von Antagonisten wurden Assay- und Datenanalyseprotokolle für die Untersuchung von GPCR-G-Protein-Kopplungsprofilen unter einheitlichen Mini-G-Protein-Expressionsniveaus erstellt. Darüber hinaus lieferte die computergestützte Analyse von H2,4R-Kopplungsprofilen an mGs, mGsi und mGsq unter Verwendung von GaMD-Simulationen einen dynamischen Einblick in die jeweilige Komplexbildung und deutete darauf hin, dass GPCRs als Voraussetzung für eine erfolgreiche Kopplung eine spezifische Orientierung des G-Proteins in der Rezeptorbindungshöhle ermöglichen müssen (z. B. in einer Gs- oder Gi-ähnlichen Position). Letztendlich sollte der Mini-G-Protein-Rekrutierungs-Assay als proximaler G-Protein-basierter Assay von hoher Qualität gut geeignet sein, um die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von Liganden im Hinblick auf die Verzerrung der Signalwege für verschiedene Arten von G-Proteinen oder Beta-Arrestinen zu bewerten, gegebenenfalls auf der Ebene des endogenen Rezeptors.
Metadata last modified: 04 Sep 2023 09:07
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